一种小分子岩藻多糖的制备方法与流程

本发明涉及一种小分子多糖的制备和分析方法，属于生物分离工程领域和海洋资源综合利用领域。

(二)

背景技术：

海洋约占地球表面积的71％，占地球总水量的97％，海洋生物的多样性提供了丰富的天然产物。海洋藻类作为一种新的生物活性物质的来源，越来越受到关注。褐藻是海洋藻类中的第二大种群，因其含有绿棕色的藻褐素而得名。褐藻(phaeophyta)分为25个属，约有1500种。其中海带(laminariajaponica)、裙带菜(undariapinnatifida)是最常见的褐藻。我国海岸线漫长，辽阔的海洋内蕴藏着丰富的藻类资源，并且我国是海藻生产和消费大国。其中海带、裙带菜是我国的传统食物，并且在过去的一千多年中，我国人民把它们当作治疗肾病水肿的传统药物。褐藻中含有的多糖成分，如褐藻胶，岩藻多糖，褐藻淀粉等，均已在医药原料中广泛的应用。

褐藻多糖(fucoidan)是kylin等1913年从掌状海带中提取得到的，岩藻多糖是一类来源于褐藻和海洋无脊椎动物的硫酸化多糖，包括海带、裙带菜和海参。它们主要含有α(1-3)-或α(1-3)-和α(1-4)-交替连接的l-岩藻糖组分，乙酰基，硫酸盐或主链中存在不同的支链，除了l-岩藻糖外，大多数褐藻多糖的聚合物骨架中还存在少量的其他单糖，如半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖。岩藻依聚糖是无毒的化合物，具有降血糖预防肥胖、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血等生物活性，但这些活性取决于它们的结构特性，如分子量，支链形式，硫酸化方式和单糖组成。目前，日本已将岩藻多糖开发为保健品。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种均一小分子岩藻多糖的水解方法，该方法保持了硫酸根含量稳定。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种均一性小分子岩藻多糖的制备方法，所述方法为：(1)粗岩藻多糖提取：将干海带粉与溶剂混合，在60-100℃浸提1-5h，将浸提液离心(优选5000-10000r/min)，获得提取液；并将提取液减压浓缩至1/2-1/15体积(优选50℃-70℃减压浓缩至1/10)，获得浓缩液；所述溶剂为体积浓度95％乙醇水溶液或去离子水；所述溶剂体积用量以干海带粉质量计为25-50ml/g(优选30ml/g)；然后向浓缩液中加质量浓度1％～4％cacl2水溶液，搅拌至无沉淀产生(优选搅拌4h)，离心，取上清液浓缩至1/2～1/3倍体积后，采用sevage法除蛋白直至水层与sevage溶液层中间未出现白色层，取水层旋转蒸发除去残留的氯仿，用14kda透析袋于去离子水中透析；取截留液加入无水乙醇至乙醇体积浓度为50％-90％，搅拌，在4℃下静置过夜，离心，沉淀干燥，得粗岩藻多糖；(2)粗岩藻多糖纯化：将粗岩藻多糖用去离子水溶解后，上样deae-52纤维素阴离子交换柱，分别用去离子水，0.3mnacl水溶液、0.6mnacl水溶液、0.9mnacl水溶液、1.5mnacl水溶液、2.0mnacl水溶液进行洗脱，分别收集0.9mnacl水溶液、1.5mnacl水溶液、2.0mnacl水溶液对应的三种流出液，分别用14kda透析袋于去离子水中透析，取截留液冻干(12-24h)，分别获得三种纯化岩藻多糖；(3)小分子岩藻多糖的制备：将步骤(2)获得的三种纯化岩藻多糖用浓度为0.01～0.2mol/l的hcl水溶液制成质量浓度为0.5～5％的岩藻多糖溶液，于30℃-100℃下搅拌水解10min-2h，反应液调ph为7(优选用1mol/l的naoh)后，用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入体积浓度10～30％h2o2水溶液溶解，再加入体积浓度5～20％氨水调节ph为8.5，室温(25-30℃)避光放置30min，离心，上清液用3.5kda透析袋于去离子水中透析，冻干，分别获得三种小分子岩藻多糖，所述小分子岩藻多糖分子量均小于10kda，优选5-9kda，最优选获得组成见表1中的lj3h，lj4h，lj5h。

进一步，优选步骤(1)所述溶剂体积用量以干海带粉质量计为40ml/g；所述浸提条件为90℃浸提3h；所述溶剂为去离子水。

进一步，优选步骤(1)浸提重复2次，具体为：将干海带粉与溶剂混合，在60-100℃浸提1-5h，将浸提液离心(优选5000-10000r/min)，沉淀加入等体积溶剂同样条件下浸提1次，合并两次浸提液即获得提取液。

进一步，优选步骤(1)sevage法除蛋白按如下步骤操作：取上清液浓缩至1/2～1/3倍体积后，加入同体积的sevage溶液，800r/min磁力搅拌器下搅拌20min，分液漏斗分成上层水层和下层sevage溶液层，取上层离心，收集上清液；重复上述除蛋白(sevage溶液、分层、离心)操作，直至水层与sevage溶液层中间未出现白色层(优选5-15次，最优选12次)；所述sevage溶液为体积比4:1的氯仿：正丁醇。

进一步，优选步骤(2)粗岩藻多糖用去离子水溶解制成质量浓度为1％-5％的溶液，优选2％。

进一步，优选步骤(3)水解反应温度为60℃，时间为1h。

进一步，优选步骤(3)岩藻多糖用浓度为0.1mol/l的hcl水溶液制成质量浓度为1％的岩藻多糖溶液。

进一步，优选步骤(3)h2o2水溶液体积加入量为浓缩后截留液体积的1/2～1/4倍。

本发明提取岩藻多糖的原料可以是人工养殖的海带(laminariajaponica)，也可以是人工养殖的裙带菜(undariapinnatifidasuringar)。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1)采用本发明方法制备的岩藻多糖的总糖含量≥50％(符合国家标准)，纯化后的岩藻多糖总糖含量均在80％以上。

2)本发明方法分离得到的小分子岩藻多糖分子量均＜10kda，lj3、lj4、lj5水解后的分子量均减小了30倍以上，且制备的lj3h、lj4h、lj5h均为均一性多糖。

3)采用本发明制备的小分子岩藻多糖硫酸根含量保持稳定，硫酸根含量的变化≤1.5％。

(四)附图说明

图1为deae-52阴离子交换树脂洗脱曲线图。

图2为lj3h(a)，lj4h(b)，lj5h(c)，lj3d(d)示差折光检测器纯度及分子量检测图。

图3岩藻多糖粘度变化曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：水煮法提取岩藻多糖和deae-52纯化岩藻多糖

1、岩藻多糖提取

(1)称取40g干海带粉(80目)，加入1200ml去离子水a于90℃浸提3h，将浸提液8000r/min下离心10min，一次过滤，获得一次提取液和一次滤渣；一次滤渣加入1200ml去离子水b同样条件下重新再提取一次，取离心后的二次提取液，合并一次提取液和二次提取液，即为提取液。将提取液体积浓缩至1/10，获得浓缩液。(2)然后向步骤(1)浓缩液中加入质量浓度2％cacl2水溶液，搅拌4h至无沉淀产生，离心，取上清液，浓缩1/3倍体积后，加入同体积的sevage溶液(氯仿：正丁醇＝4:1，v/v)，800r/min磁力搅拌器下搅拌20min，分液漏斗分成上层水层和下层sevage溶液层，取上层离心，收集上清液。重复上述除蛋白(sevage溶液、分层、离心)操作12次，直至水层与sevage溶液层中间未出现白色层。取水层旋转蒸发除去残留的氯仿，用14kda透析袋于去离子水中透析。取截留液加入无水乙醇至乙醇体积浓度为75％，磁力搅拌，在4℃下静置过夜，离心，沉淀烘干，得粗岩藻多糖2.5g，记为粗岩藻多糖la。

2、纯化岩藻多糖

称取步骤1制备的1.0g粗岩藻多糖la，用去离子水配置质量浓度为2％(m/m)的溶液，上样deae-52纤维素阴离子交换柱(3.8cm×30cm)，分别用纯水，0.3mnacl水溶液、0.6mnacl水溶液、0.9mnacl水溶液、1.5mnacl水溶液、2.0mnacl水溶液进行洗脱，分别得到馏分la1h，馏分lj1，馏分lj2，馏分lj3，馏分lj4，馏分lj5，每个馏分用硫酸苯酚法检测，如图1，然后对6个组分浓缩至1/10体积，用14kda的透析袋于去离子水中透析48h，取截留液冻干，分别得到六种岩藻多糖，记为岩藻多糖la1h，岩藻多糖lj1，岩藻多糖lj2，岩藻多糖lj3，岩藻多糖lj4，岩藻多糖lj5。

实施例2：岩藻多糖水解条件优化和小分子多糖制备

(1)岩藻多糖水解条件优化：分别称取18份实施例1制备的岩藻多糖(lj3，lj4，lj5各6份)每份100mg，加入不同浓度的盐酸水溶液(0.01m，0.05m，0.1m)配置为质量浓度1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在不同温度下水解，水解条件：0.01m(80℃，100℃)，0.05m(60℃，80℃)，0.1m(60℃，100℃)。tlc法检测其水解程度，黏度法检测其水解速率，确定最佳水解条件，结果见图3。本发明优化的水解条件确定为0.1mol/lhcl、60℃水解1h。

(2)小分子多糖制备：

1)取实施例1制备的1.0g岩藻多糖lj3，用0.1mol/lhcl配置质量浓度为1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在60℃下反应1h，1mol/lnaoh调节ph为7，用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入1/5倍体积的体积浓度30％h2o2水溶液，再加入体积浓度10％氨水调节ph为8.5，室温下避光反应30min，离心，上清液用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，取截留液冻干12h，得小分子岩藻多糖0.632g，记为小分子岩藻多糖lj3h，其总糖含量为89.03％，硫酸根含量为7.44％，平均分子量为6.21kda，中性单糖摩尔组成甘露糖：葡萄糖：半乳糖：岩藻糖＝6.49:5.24:3.54:84.74，总糖含量增加，硫酸根含量变化＜1.5％，分子量减小了40倍。

2)取实施例1制备的1.0g岩藻多糖lj4，用0.1mol/lhcl配置质量浓度为1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在60℃下反应1h，1mol/lnaoh调节ph为7，用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入1/5倍体积的体积浓度30％h2o2水溶液，再加入体积浓度10％氨水调节ph为8.5，室温下避光反应30min，离心，上清液用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，冻干12h，得小分子岩藻多糖0.598g，记为小分子岩藻多糖lj4h，其总糖含量为92.13％，硫酸根含量为18.86％，平均分子量为8.07kda，中性单糖摩尔组成甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：岩藻糖＝0.94:1.34:0.21:35.22:62.29，总糖含量增加，硫酸根含量变化＜1.5％，分子量减小了100倍。

3)取实施例1制备的1.0g岩藻多糖lj5，用0.1mol/lhcl配置质量浓度为1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在60℃下反应1h，1mol/lnaoh调节ph为7，用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入1/5倍体积的体积浓度30％h2o2溶液，再加入体积浓度10％氨水调节ph为8.5，室温下避光反应30min，离心，上清液用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，冻干12h，得小分子岩藻多糖0.611g，记为小分子岩藻多糖lj5h，分子量为5.37kda，总糖含量为93.13％，硫酸根含量为20.22％，平均分子量为5.37kda，中性单糖摩尔组成半乳糖：岩藻糖＝53.78：46.22，总糖含量增加，硫酸根含量变化＜1.5％，分子量减小了30倍。

4)取实施例1制备的1.0g岩藻多糖lj3，用0.005mol/lhcl配置质量浓度为1％(m/m)的岩藻多糖溶液，在60℃下反应1h，1mol/lnaoh调节ph为7，用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，取截留液浓缩至1/3体积后，加入1/5倍体积的体积浓度30％h2o2水溶液，再加入体积浓度10％氨水调节ph为8.5，室温下避光反应30min，离心，上清液用3.5kda透析袋于去离子水中透析24h，取截留液冻干12h，得岩藻多糖lj3d，示差折光检测器检测如图2(d)。不符合制备小分子均一多糖的要求，分子量降低很少。

实施例3：岩藻多糖的理化性质检测

(1)总糖含量检测：分别称取实施例1和实施例2制备的0.01g岩藻多糖(岩藻多糖lj3，岩藻多糖lj4，岩藻多糖lj5，小分子岩藻多糖lj3h，小分子岩藻多糖lj4h，小分子岩藻多糖lj5h)用去离子水定容至100ml，作为样品溶液。称取0.01g岩藻糖标准品，用去离子水定容至100ml，移取标品溶液0ml、1ml、3ml、5ml、7ml、9ml于10ml容量瓶中，去离子水定容，作为待测标品溶液。分别取1ml上述各个浓度的待测标品溶液和样品溶液于试管中，向其中分别加入体积浓度5％苯酚水溶液1ml，迅速加入5ml浓硫酸(质量浓度98％)，涡旋混合，490nm处测定吸光度，结果见表1。

(2)硫酸根含量检测：称取硫酸钾35mg，用蒸馏水配成100ml标准硫酸钾溶液。分别取标准硫酸钾溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml，加蒸馏水定容至3ml，加0.2mhcl3.8ml，明胶氯化钡1ml，充分摇匀，室温(25-30℃)放置30min后于500nm处测其吸光度。实施例1和实施例2制备的岩藻多糖(岩藻多糖lj3，岩藻多糖lj4，岩藻多糖lj5，小分子岩藻多糖lj3h，小分子岩藻多糖lj4h，小分子岩藻多糖lj5h)样品用2mol/lhcl水解，取配制的0.1％样品溶液1ml，按上述方法加入hcl和明胶氯化钡，测其吸光度，结果见表1。

(3)样品中性糖成分检测：以甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖等作为标准品，pmp法柱前衍生化，hplc(流动相：磷酸盐：乙腈＝82:18，流速：1ml/min，254nm处检测)检测实施例1和实施例2制备的岩藻多糖(岩藻多糖lj3，岩藻多糖lj4，岩藻多糖lj5，小分子岩藻多糖lj3h，小分子岩藻多糖lj4h，小分子岩藻多糖lj5h)样品中单糖组分。

(4)分子量和纯度检测：以不同分子量(4.3kda、1.26kda、6.06kda、123.5kda、420kda、821.7kda)的葡聚糖作为标准品，示差折光检测器(流动相：0.2mnacl，流速：0.5ml/min)检测实施例1和实施例2制备的岩藻多糖(岩藻多糖lj3，岩藻多糖lj4，岩藻多糖lj5，小分子岩藻多糖lj3h，小分子岩藻多糖lj4h，小分子岩藻多糖lj5h)样品的分子量和纯度，如表1和图2。

(5)岩藻多糖的理化性质如表1

表1岩藻多糖理化性质

*未检测出。