一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法与流程

本发明涉及一种可溶性生长刺激表达基因2(solublegrowthstimμlationexpressedgene2,sst2)蛋白的表达方法，特别涉及一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法。本发明属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：生长刺激表达基因2蛋白(growthstimulationexpressedgene2，st2)是il-1受体超家族成员，最先由tominaga在1989年发现，长期以来被认为是一个孤儿受体与炎症和免疫性疾病相关，到2005年发现了它的特异性配体il-33，于是对st2的研究扩展到一个新的领域。人st2的基因位于染色体2q12，约40kd，表达于肥大细胞、巨噬细胞、激活的辅助性t细胞2(th2)、心肌细胞和心肌成纤维细胞。st2基因有4种转录产物，其中2个最重要的亚型是跨模型st2(st2l)和可溶性st2(sst2)，是由启动子选择性剪切和3′端加工形成的。st2l包括一个胞外结构域是由3个连续的免疫球蛋白模体组成、一个跨膜结构域和一个toll/il-1受体(tir)胞内结构域；与st2l相比，sst2缺失跨膜及胞内结构域，仅由一个含9个氨基酸的c末端序列组成，可以分泌到细胞外。st2基因在心肌细胞和心肌成纤维细胞遭受机械张力时均会上调表达，st2l/il33信号通路的正常激活能保护心血管，避免心肌由于过度牵拉造成的损伤，sst2作为il-33的诱骗受体，与il-33结合后阻断il-33与st2l的结合，减弱其下游通路激活所起的心脏保护作用，进而加重心肌重塑和心功能障碍，并与增加心衰、心肌梗死、心血管性死亡等不良心血管事件的发生。血液中sst2浓度常被用于评估急性心梗患者预后情况，在体外诊断领域，sst2常被用作相应检测试剂盒的校准品。sst2也被用于一些科学研究中，例如：st2/白细胞介素-33的信号转导。天然的sst2蛋白提取难度较大，尚未见相关报道。sst2重组蛋白在原核表达时以包涵体形式存在，经过变性复性处理，生物学活性较低，不能用作st2检测试剂盒校准品，应用范围窄。酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统是常见的真核表达系统，目前市面上有哺乳动物细胞表达的sst2重组蛋白和昆虫细胞表达的sst2出售，产量有限，售价昂贵，同时缺乏相应的诊断试剂相关的评测数据，是否适用于诊断试剂领域有待考察。因此，目前在诊断试剂领域，缺少成本可控、活性良好并且评测完整的sst2生产方案，规模化生产受阻，限制了st2相关检测项目的发展。因此，急需建立一种能够低成本、高效率表达有生物活性的可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法，以满足当前对可溶性生长刺激表达基因2蛋白相关研究以及应用的需求。技术实现要素：本发明的目的是建立一种能够低成本、高效率表达有生物活性的可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：本发明的一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2(sst2)蛋白的方法，包括以下步骤：1)表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种的构建人工合成编码sst2融合蛋白的dna序列，合成时在其c端引入6个组氨酸标签，在n端和c端预留酶切位点，目的片段和载体经过双酶切后进行连接，构建含有可溶性生长刺激表达基因2的重组质粒；质粒先进行线性化，然后通过电转的方式转入酵母菌感受态中，构建得到表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种；2)将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种划线培养后，接种培养基，进行一级种子和二级种子的培养；将得到的二级种子接种于摇瓶或发酵罐中，继续诱导培养，获得发酵液；将发酵液转移至离心桶中，离心，收集上清；3)纯化对收集的上清进行纯化，得到纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白。其中，优选的，步骤1)中所述的编码sst2融合蛋白的dna序列如seqidno.1所示。其中，优选的，步骤1)中所述的载体为ppic9k载体，所述的酵母菌为gs115毕赤酵母表达菌。其中，优选的，步骤2)中，采用摇瓶培养时，按照以下步骤进行：将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种在md平板上划线接种，挑取单菌落接种至20mlypd培养基，160rpm30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子；将一级种子按1：100接种至80ml的ypd培养基，160rpm30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为二级种子；将40ml的二级种子接种至2l的bmgy培养基中，混匀后平均分装到10个1l的三角瓶中，30℃160rpm震荡培养；连续培养4天，每24h添加1.5v/v％的甲醇诱导表达，第7天结束发酵；发酵液转移至离心桶中，10000g离心10min，收集上清。其中，优选的，步骤2)中，采用发酵罐培养时，按照以下步骤进行：将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种在md平板上划线接种，挑取单菌落接种至20mlypd培养基，160rpm30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子；将一级种子按1：100接种至400ml的bmgy培养基中160rpm30℃震荡培养24h，待od600达到6时即可作为二级种子；选择5l发酵罐，发酵罐中预先装入2l的初始bmgy培养基并灭菌；灭菌结束后，无菌加入300mlmgso4，300ml10*ynb，标定溶氧为100％，加入准备好的400ml二级种子开始发酵；0-96h始终保持30℃，ph始终保持6.0，0-22h补甘油248ml，流速控制在11.27ml/min，0-7hdo和转速串联，保证do>30％，转速控制在200-800rpm之间，7h后取消串联，改为自动布控，每小时增加转速50rpm，达到800rpm后维持至发酵结束；发酵24h后补加混合氮源，24h-72h流速控制在1ml/h/l，72h-96h控制流速在1.2ml/h/l；发酵24h开始甲醇诱导，23h-27h控制流速在1ml/h/l，27h-29h控制流速在2ml/h/l，29h-48h控制流速在3ml/h/l，48h-60h控制流速在4ml/h/l，60h-66h控制流速在4.5ml/h/l，66h-72h控制流速在5ml/h/l，72h-96h控制流速在5.5ml/h/l直至发酵结束；发酵48h时，转速调至950rpm/min，保证do≥30％，直至发酵结束。其中，优选的，步骤3)中，所述的纯化是采用超滤浓缩、ni柱亲和纯化以及sp柱捕获的方法进行蛋白的纯化。其中，优选的，所述的超滤浓缩是将发酵上清用0.8um、0.45um和0.22um的滤膜过滤，选择50cm210kd膜包，膜包用去离子水冲洗后，加入滤好的样品，将样品的体积浓缩到50-100ml。浓缩样品用2l的超滤缓冲液(0.15mpbs，ph7.4)平衡洗涤至透过液无色，最终保证样品终体积小于100ml，收集置换过缓冲液的样品，添加0.05w/v％nan3，2-8℃短期保存。其中，优选的，所述的ni柱亲和纯化是选择5mlni柱，a液为0.15mpbsph7.4，b液为0.15mpbs+0.5m咪唑ph7.4；预先用a液平衡ni柱，将超滤处理过的酵母上清上样，上样完成后用a液再次平衡，然后依次用5％b液、25％b液、50％b液和100％b液洗脱，收集洗脱峰。其中，优选的，所述的sp柱捕获是将sp柱预先用10mmpbph6.0平衡，平衡好后将收集的样品洗脱峰上样，一步100％ph6.0含1mnacl的10mmpb溶液洗脱，收集洗脱峰。其中，优选的，所述的方法还包括对纯化后的纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白进行活性检测的步骤：在elisa板上包被il-33，优选的，包被浓度为2μg/ml，然后加入梯度稀释的纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白，用hrp标记的st2单抗进行检测。相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的sst2重组蛋白表达和纯化方法，通过酵母表达系统表达sst2重组蛋白，利用发酵罐技术提高产量，并且证明酵母源sst2具有良好的生物学活性，稳定性良好，应用验证显示其可以作为sst2化学发光检测试剂盒校准品。此外，本发明还建立了一种全新的表达量检测方法，完成了诊断试剂盒的应用验证，解决了目前sst2规模化生产方面的多个难点，能够满足诊断试剂领域对sst2需求，为sst2规模化生产提供新思路。附图说明图1为sst2纯度鉴定；图2为标准曲线。具体实施方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1sst2的摇瓶发酵1、实验材料ppic9k载体质粒、gs115菌种、ppic9k-st2gs115菌种、il33和6b11单抗由本公司保存；ynb购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨和酵母粉购自oxoidltd；生物素购自sigma；ni柱和sp柱购自常州天地人和生物科技有限公司；hf酶和酶切buffer购自neb(北京)有限公司。2、试验方法1)ppic9k-st2gs115菌种的构建人工合成编码sst2融合蛋白的dna序列(seqidno.1所示)，合成时在其c端引入6个组氨酸标签，对应的氨基酸序列见(seqidno.2所示)，在n端和c端预留酶切位点，目的片段和载体经过snabi与noti双酶切后进行连接，构建ppic9k-st2重组质粒。质粒先进行线性化，然后通过电转的方式转入gs115感受态中，通过md平板筛选和菌落pcr鉴定，找到构建成功的菌种，命名为ppic9k-st2gs115。2)ppic9k-st2gs115菌种的摇瓶发酵将ppic9k-st2gs115菌种在md平板上划线接种，挑取单菌落接种至20mlypd培养基，160rpm30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子。将一级种子按1：100接种至80ml的ypd培养基，160rpm30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为二级种子。将40ml的二级种子接种至2l的bmgy培养基中，混匀后平均分装到10个1l的三角瓶中，30℃160rpm震荡培养。连续培养4天，每24h添加1.5v/v％的甲醇诱导表达，第7天结束发酵。发酵液转移至离心桶中，10000g离心10min，收集上清，弃菌泥，上清合并后总体积为1.9l。3)纯化工艺3.1超滤浓缩发酵上清用0.8um、0.45um和0.22um的滤膜过滤，选择50cm210kd膜包(millipore)，膜包用去离子水冲洗后，加入滤好的样品，将样品的体积浓缩到50-100ml。浓缩样品用2l的超滤缓冲液(0.15mpbs，ph7.4)平衡洗涤至透过液无色，最终保证样品终体积小于100ml，收集置换过缓冲液的样品，添加0.05％nan3，2-8度短期保存。3.2ni柱亲和纯化选择5mlni柱，a液为0.15mpbsph7.4，b液为0.15mpbs+0.5m咪唑ph7.4。预先用a液平衡ni柱，将超滤处理过的酵母上清上样，上样完成后用a液再次平衡，然后依次用5％b液、25％b液、50％b液和100％b液洗脱，收集洗脱峰。3.3sp柱捕获sp柱预先用10mmpbph6.0平衡，平衡好后将上步收集的样品洗脱峰上样，一步100％b(ph6.0含1mnacl的10mmpb溶液)洗脱，收集洗脱峰。4)重组sst2蛋白检测4.1纯度检测取30μl上步纯化得到的样品，加入4μl的10*denaturebuffer，100℃水煮10min，然后取出。样品冷却到室温后加入4μl的10*g5buffer，1μl的hf酶和1μl的ddh2o，加完后充分混匀，37℃反应1h。hf酶切完成后加入10μl的5*蛋白上样buffer，水煮10min后通过sds-page检测。结果显示：纯化得到的sst2具有很高的糖基化程度，蛋白大小约35kd，与预期结果一致(图1)。4.2重组sst2和配体结合活性的检测在elisa板上包被il-33，包被浓度为2μg/ml，然后加入梯度稀释的st2重组蛋白，用hrp标记的st2单抗检测，结果显示：纯化得到的st2能够和配体结合(表1)。表1il-33/st2结合活性检测(吸光值(od值))5)重组sst2试剂盒应用验证将sst2稀释成工作浓度，用sst2化学发光检测试剂盒完成定标，结果显示：本发明利用酵母表达系统表达的sst2能作为该项目校准品使用(表2、图2)。表2试剂盒应用验证浓度ng/ml(x值)rlu(y值)010608.625.382375.4120.831280054834677.5157266172132053350086)基于il33与sst2特异性单抗的elisa方法的建立在elisa板上包被il-33，包被浓度为2μg/ml，然后加入梯度稀释的sst2重组蛋白，用hrp标记的st2单抗6b11检测，结果显示：纯化得到的sst2能够和配体结合，并呈剂量依赖性(表1)。因此，il-33和6b11单抗可以成功配对，形成类似夹心elisa方法定量检测sst2的表达。实施例2sst2的发酵罐发酵1)ppic9k-st2gs115菌种的构建同实施例1。2)sst2的发酵罐发酵将ppic9k-st2gs115菌种在md平板上划线接种，挑取单菌落接种至20mlypd培养基，160rpm30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子。将一级种子按1：100接种至400ml的bmgy培养基中160rpm30℃震荡培养24h，待od600达到6时即可作为二级种子。选择上海保兴5l发酵罐，发酵罐中预先装入2l的初始培养基并灭菌。灭菌结束后连接发酵罐和控制器、通气系统、冷凝系统、ph、溶氧、补料瓶、酸碱瓶，无菌加入300mlmgso4，300ml10*ynb，标定溶氧为100％，加入准备好的400ml二级种子开始发酵。温度自动控制：0-96h始终保持30℃，ph自动控制，始终保持6.0。甘油补料：0-22h补248ml，流速控制在11.27ml/min。转速控制：0-7hdo和转速串联，保证do>30％，转速控制在200-800rpm之间，7h后取消串联，改为自动布控，每小时增加转速50rpm，达到800rpm后维持至发酵结束。发酵24h后补加混合氮源，24h-72h流速控制在1ml/h/l，72h-96h控制流速在1.2ml/h/l。发酵24h开始甲醇诱导，23h-27h控制流速在1ml/h/l，27h-29h控制流速在2ml/h/l，29h-48h控制流速在3ml/h/l，48h-60h控制流速在4ml/h/l，60h-66h控制流速在4.5ml/h/l，66h-72h控制流速在5ml/h/l，72h-96h控制流速在5.5ml/h/l直至发酵结束。发酵48h时，转速调至950rpm/min，保证do≥30％，直至发酵结束。3)纯化工艺同实施例1。4)重组sst2蛋白检测发酵结束后，通过实施例1建立的elisa方法检测表达量，结果显示目的蛋白大量表达(表3)。按照摇瓶纯化工艺纯化，最终获得约60mg的目的蛋白，比摇瓶提高20倍。表35l发酵罐表达检测序列表<110>北京利德曼生化股份有限公司<120>一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法<160>2<170>patent-in3.5<210>1<211>965<212>dna<213>growthstimulationexpressedgene2<400>1tacgtaaagttcagcaagcagagttggggtcttgagaacgaagcactgatcgttcgttgt60ccacgtcaaggtaagccaagctacactgtggattggtactacagccagaccaacaagagc120atcccaactcaggaacgtaaccgtgtgttcgcaagtggtcagcttctgaagttccttcca180gcagcagttgcagatagtggtatctacacctgcatcgtgcgtagtccaaccttcaaccgt240actggttacgcaaacgtgaccatctacaagaagcagagcgattgcaacgtgccagactac300ctgatgtacagcactgtgagtggtagcgagaagaacagcaagatctactgtccaaccatc360gatctgtacaactggactgcaccactggaatggttcaagaactgccaggcactgcagggt420agtcgttatcgtgcacacaagagcttcctggtgatcgacaacgtgatgaccgaagatgca480ggtgactacacctgcaagttcatccacaacgagaacggtgcaaactacagcgtgactgca540actcgtagcttcaccgtgaaggatgaacagggtttcagcctgttcccagtgatcggtgca600ccagcacagaacgagatcaaggaagtggagatcggaaagaacgcaaacctgacctgcagt660gcatgcttcggtaagggtactcagttcctggcagcagttctgtggcaactgaacggtacc720aagatcaccgatttcggtgaaccacgtatccagcaggaagaaggtcagaaccagagcttc780agcaacggtctggcatgcctggatatggtgctgcgtatcgcagatgtgaaggaagaagat840ctgcttctgcagtacgattgcctggcactgaacctgcatggtctgcgtcgtcatactgtg900cgtctgagtcgtaagaacccaatcgatcaccatagccatcatcaccaccaccactaagcg960gccgc965<210>2<211>316<212>prt<213>growthstimulationexpressedgene2<400>2lyspheserlysglnsertrpglyleugluasnglualaleuilevalargcysproarg20glnglylysprosertyrthrvalasptrptyrtyrserglnthrasnlysserilepro40thrglngluargasnargvalphealaserglyglnleuleulyspheleuproalaala60valalaaspserglyiletyrthrcysilevalargserprothrpheasnargthrgly80tyralaasnvalthriletyrlyslysglnseraspcysasnvalproasptyrleumet100tyrserthrvalserglyserglulysasnserlysiletyrcysprothrileaspleu120tyrasntrpthralaproleuglutrpphelysasncysglnalaleuglnglyserarg140tyrargalahislysserpheleuvalileaspasnvalmetthrgluaspalaglyasp160tyrthrcyslyspheilehisasngluasnglyalaasntyrservalthralathrarg180serphethrvallysaspgluglnglypheserleupheprovalileglyalaproala200glnasngluilelysgluvalgluileglylysasnalaasnleuthrcysseralacys220pheglylysglythrglnpheleualaalavalleutrpglnleuasnglythrlysile240thrasppheglygluproargileglnglnglugluglyglnasnglnserpheserasn260glyleualacysleuaspmetvalleuargilealaaspvallysglugluaspleuleu280leuglntyraspcysleualaleuasnleuhisglyleuargarghisthrvalargleu300serarglysasnproileasphishisserhishishishishishis***316当前第1页12