用于临床上人五毛滴虫感染特异巢式PCR检测试剂盒的制作方法

本发明提供一种用于临床上人五毛滴虫感染特异巢式pcr检测试剂盒，用于肿瘤患者等其他人群（或动物粪便或污染水样）中人五毛滴虫感染的检测，本发明还公开了上述pcr检测的制备方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术：

人五毛滴虫（pentatrichomonashominis），是一种重要的人兽共患寄生虫，可在人、犬、猪、猫、非人灵长类及啮齿类等动物的大肠内繁殖，经粪便排出体外，滋养体可在宿主间直接传染，临床上肿瘤患者有较高的感染率。国内外已报道的人五毛滴虫的检测方法有涂片镜检法、培养法、普通pcr检测法、原位杂交检测法等。

基因组dna是十分稳定的，它贯穿于寄生虫的整个生活史周期。聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)是目前灵敏度高且易于操作的dna检测技术。由于粪便样本成分复杂，其中含有大量细菌，使用普通pcr方法进行检测时经常会有非特异性条带或假阳性结果出现。而巢式pcr的特异性、敏感性较普通pcr均更高。本发明以人五毛滴虫18srrna基因部分序列为目标序列，设计两对特异性巢式pcr引物，建立巢式pcr检测方法，用于临床上粪样（或污染水样）中人或动物人五毛滴虫的检测。

技术实现要素：

本发明公开了一种用于临床上人五毛滴虫感染特异巢式pcr检测试剂盒，可以准确检测出检测人粪便或动物粪便或污染水样中人五毛滴虫的感染情况。

本发明一种用于临床上人五毛滴虫感染特异巢式pcr检测试剂盒，包括两对巢式pcr引物、dntp、pcrbuffer、rtaq酶、mg2+溶液和ddh2o；其中，

1）pcr反应液：

dntpmixture（2.5mm/each）4μl；

10×pcrbuffer（mg²⁺free）5μl；

mgcl2（25mm）8μl；

dna模板1μl；

rtaqpolymerase（5u/μl）0.25μl；

addddh2o50μl；

2）两对巢式pcr引物各1.0μl为：

f1：5'-atggcgagtggtggaata-3'；

r1：5'-cccaactacgctaaggatt-3'；

f2：5'-tgtaaacgatgccgacagag-3'；

r2：5'-caacactgaagccaatgcgagc-3'。

上游引物(15pm)1.0μl；

下游引物(15pm)1.0μl；

3）对照：阳性对照的dna模板为人五毛滴虫基因组dna；

阴性对照的为ddh2o，用于比较pcr产物以及监测pcr操作过程是否有污染。

本发明所述的一种用于临床上人五毛滴虫感染特异巢式pcr检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1）、pcr扩增：

（1）准备待检样品数+2的pcr反应管并分别标记，管内加入pcr反应液；dna模板分别为待检样品、阴性对照和阳性对照，涡旋混匀后瞬时离心，待用；

（2）第一轮pcr反应条件为：95℃预变性3min、95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸38s,共33个循环，72℃延伸7min；

（3）以第一轮pcr反应产物为模板进行第二轮pcr，第二轮pcr反应条件为：95℃预变性3min、95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸20s,共33个循环，后72℃延伸10min；

2）、pcr产物观察：

配制1.0%琼脂糖凝胶，加样后120v-130v电压下电泳20-30min，之后在紫外灯或凝胶成像系统下观察实验结果，样品存在339bp的扩增条带即判定该样品感染了人五毛滴虫。

本发明的积极效果在于：提供了一种巢式pcr检测试剂盒，通过两次pcr扩增使得检测方法具有较高的灵敏度，用于临床上人或动物粪便（或污染水样）中人五毛滴虫感染的特异、敏感和快速检测；具有良好的特异性，减低了对检测样品的误判；在粪便污染防控预警方面具有很高的应用价值。

附图说明

图1a：本发明第一轮退火温度优化；

图1b：本发明第二轮退火温度优化；

图2：本发明巢式pcrmg2+体系优化；

图3：本发明巢式pcr灵敏性—不同人五毛滴虫虫量；

图4：本发明巢式pcr敏感性—不同人五毛滴虫基因浓度；

图5：本发明巢式pcr特异性；

图6：本发明45份虎粪样品人五毛滴虫巢式pcr检测；

图7：本发明15份人粪便人五毛滴虫巢式pcr检测。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例1

一种用于临床上人五毛滴虫感染特异巢式pcr检测试剂盒，包括两对巢式pcr引物、dntp、pcrbuffer、rtaq酶、mg²⁺溶液和ddh2o；其中，

1）pcr反应液：

dntpmixture（2.5mm/each）4μl；

10×pcrbuffer（mg²⁺free）5μl；

mgcl2（25mm）8μl；

dna模板1μl；

rtaqpolymerase（5u/μl）0.25μl；

addddh2o50μl；

2）两对巢式pcr引物各1.0μl为：

f1：5'-atggcgagtggtggaata-3'；

r1：5'-cccaactacgctaaggatt-3'；

f2：5'-tgtaaacgatgccgacagag-3'；

r2：5'-caacactgaagccaatgcgagc-3'。

上游引物(15pm)1.0μl；

下游引物(15pm)1.0μl；

3）对照：阳性对照的dna模板为人五毛滴虫基因组dna；

阴性对照的为ddh2o，用于比较pcr产物以及监测pcr操作过程是否有污染。

实施例2巢式pcr引物设计

人五毛滴虫种特异诊断序列：选择具有高度保守性的18srrna基因部分序列，ncbi中比对其为人五毛滴虫所特有，符合种特异检测研究标准。根据人五毛滴虫特异序列设计特异性诊断引物如下：

第一轮pcr引物：f1：5'-atggcgagtggtggaata-3'；

r1：5'-cccaactacgctaaggatt-3'；

第二轮pcr引物：f2：5'-tgtaaacgatgccgacagag-3'；

r2：5'-caacactgaagccaatgcgagc-3'；

以上两对引物中f1-r1为第一轮pcr引物，f2-r2为第二轮pcr引物，能扩增出339bp大小诊断基因片断，目的条带明亮，无非特异性杂带。能够实现灵敏、特异地诊断出人五毛滴虫的目的。

实施例3pcr反应条件的优化

本发明巢式pcr反应条件的优化过程为：

第一轮pcr退火温度的优化：进行温度梯度pcr扩增，设置退火温度分别为52.0℃，52.6℃，54.3℃，55.0℃，56.5℃，57.8℃，58.4℃，59.5℃，60.3℃，62.0℃，结果显示最佳退火温度为55.0℃（见附图1a）。

第二轮pcr退火温度的优化：进行温度梯度pcr扩增，设置退火温度分别为55.0℃，56.3℃，57.5℃，58.2℃，59.6℃，60.5℃，61.4℃，63.0℃，结果显示最佳退火温度为55.0℃（见附图1b）。

mg²⁺浓度的优化：设置mg²⁺浓度梯度分别为0.125mmol/l、0.25mmol/l、0.375mmol/l、0.5mmol/l、1mmol/l、1.5mmol/l、2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l、5mmol/l、6mmol/l，结果显示最佳mg²⁺浓度为4mmol/l(见附图2)。

实施例4巢式pcr灵敏度

将体外培养的人五毛滴虫计数后，依次倍比稀释为10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰、10^-1、10^-2个，用市售的粪便基因组提取试剂盒提取各样品的基因组dna，最终所得dna体积为50μl。应用上述含不同虫体数量的粪便样本所提取的基因组dna作为模板（每个反应1μl）进行pcr扩增，即每个反应中分别含10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰、10^-1、10^-2个人五毛滴虫的dna，以此来确定巢式pcr的灵敏度。最终确定巢式pcr可检测到粪便中1个人五毛滴虫的dna（见附图3）。

将体外纯培养的人五毛滴虫提取基因组dna，测量dna浓度，依次倍比稀释为500ng/μl、250ng/μl、125ng/μl、62ng/μl、31ng/μl、15ng/μl、7.5ng/μl、3.75ng/μl、1.8ng/μl、0.9ng/μl、0.45ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.06ng/μl、0.03ng/μl、0.015ng/μl。应用上述不同浓度基因组dna作为模板（每个反应1μl）进行pcr扩增，以此来确定巢式pcr的灵敏度。最终确定巢式pcr可检测到dna浓度为0.03ng/μl的人五毛滴虫（见附图4）。

实施例5巢式pcr特异性

pcr检测方法能否用于诊断人五毛滴虫感染，其特异性是关键因素。为了确定巢式pcr特异性，本实验选取了1：人五毛滴虫；2：十二指肠贾第虫；3：阴道毛滴虫；4：犬新孢子虫；5：柔嫩艾美尔球虫；6：大肠杆菌；7：球菌；来确定我们所建立的巢式pcr检测方法是否特异，结果可见只有人五毛滴虫出现特异性条带，证明所建立的巢式pcr方法特异性良好（见附图5）。

实施例6实际样品检测

采集虎粪样45份、人肿瘤患者粪样15份，用市售的粪便基因组提取试剂盒提取粪便基因组dna，经巢式pcr检测分别有9、13个阳性结果，对所有阳性样本的pcr产物进行测序，测序结果均与人五毛滴虫序列相符（见附图6、7）。

序列表

<110>吉林大学

<120>用于临床上人五毛滴虫感染特异巢式pcr检测试剂盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工引物(人工引物)

<400>1

atggcgagtggtggaata18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工引物(人工引物)

<400>2

cccaactacgctaaggat18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工引物(人工引物)

<400>3

tgtaaacgatgccgacagag20

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工引物(人工引物)

<400>4

caacactgaagccaatgcgagc22