一种用于防治小瓜虫的抗菌肽的制作方法

本发明属于水产养殖
技术领域：
，具体涉及一种体外防治小瓜虫的抗菌肽及其应用。
背景技术：
：小瓜虫病又称白点病，是淡水鱼类常见寄生虫疾病，感染鱼的体表、鳃和鳍条上有很多肉眼可见的小白点。病鱼感染小瓜虫后食欲不振，寄生鳃部位会导致鳃上皮细胞肿胀、坏死，从而影响鱼体呼吸，另外小瓜虫破囊而出时，导致伤口处又继发感染、溃烂，导致鱼大批量死亡，给养殖户带来严重的经济损失。对于小瓜虫病的治疗，已筛选的有效治疗药物如孔雀石绿、硝酸亚汞、醋酸亚汞，均由于毒性强、致癌、环境污染严重而被禁用。近年来中草药上筛选的辣椒、生姜、五倍子等和高锰酸钾、氯化钠、福尔马林、硫酸铜等有一定疗效，但大多数药物仅对掠食体阶段有一定效果，对滋养体阶段效果并不显著。目前暂无较理想治疗小瓜虫药物。抗菌肽是广泛存在于自然界生物体中的小分子多肽类物质，是生物体内先天性免疫重要组分，因其具有广谱高效抗菌活性，不易产生耐药性等特点，被认为是抗生素的最理想替代品。研究表明，抗菌肽不仅具有抗细菌、真菌、病毒、寄生虫等作用，在生物体内还具有调节炎症反应，趋化免疫细胞和促进细胞吞菌等作用，成为国内外研究热点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种从黄颡鱼中分离获得的抗菌肽及其应用，该抗菌肽对水产动物无毒害，对环境无污染，对寄生于淡水鱼类的小瓜虫均有效果，尤其对寄生于鱼体表的小瓜虫滋养体阶段仅需15μg/ml即可完全杀死。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种抗菌肽，名为ychβ，基于黄颡鱼基因组、蛋白组，通过生物信息学技术分析得到，其序列为aaklgpaaftpevhetwqkflnvvvaalckqyh，seqidno.1。基于多肽序列通过化学合成人工多肽，其纯度大于90％。抗菌肽ychβ在制备杀灭小瓜虫药物中的应用：经试验证实，ychβ对小瓜虫的不同生活史阶段均有效果，仅需要15μg/ml即可完全杀死小瓜虫滋养体阶段，125μg/ml可完全杀死小瓜虫掠食体阶段，当浓度大于500μg/ml时，可破坏包囊期阶段小瓜虫的厚厚的包囊膜，随后里面的子代虫体溶解。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明所设计的抗菌肽ychβ具有肽段序列短，稳定性较好，可人工合成等特点。目前治疗小瓜虫的大多数药物仅对水体中游离的掠食体阶段有一定效果，对寄生宿主的滋养体阶段无明显成效；本发明抗菌肽仅需要15μg/ml即可完全杀死小瓜虫滋养体阶段，125μg/ml可完全杀死小瓜虫掠食体阶段，当浓度大于500μg/ml时，可破坏包囊期阶段小瓜虫的厚厚的包囊膜，随后里面的子代虫体溶解。该抗菌肽作为黄颡鱼先天性免疫组分，对鱼体无副作用，对环境无污染。除此之外，ychβ也对寄生于金鱼、乌鳢、赤眼鳟和加州鲈的小瓜虫具有较好杀伤效果。附图说明图1为人工合成的抗菌肽ychβ的质谱图。图2为抗菌肽ychβ对滋养体的作用效果(放大100倍)，a为处理前的滋养体，b为15μg/ml抗菌肽处理后的滋养体。图3抗菌肽对包囊体的作用效果(放大100倍)，a为处理前的包囊体，b为500μg/ml抗菌肽处理后的包囊体，箭头所指为包囊膜。图4为抗菌肽对掠食体的作用效果(放大100倍)，a为处理前的掠食体，b为125μg/ml抗菌肽处理后的掠食体。具体实施方式为了更清楚的了解本发明的抗菌肽的药效，通过以下具体实施例子对本发明进一步描述。实施例1抗菌肽ychβ的开发制备鱼类的皮肤长期浸泡在含有各种细菌和寄生虫的水环境中。对于无鳞片的黄颡鱼来说，这层覆盖在体表的粘液对于抵抗外源病原的感染尤为重要。我们通过小瓜虫感染黄颡鱼并收集免疫前和免疫后存活下来的黄颡鱼粘液再使用冻干机使粘液在真空冰冻环境下干燥成粉末，溶于水后发现免疫后的黄颡鱼粘液对小瓜虫滋养体有杀伤效果，利用lc-ms/ms技术测量黄颡鱼免疫前后的蛋白质组，找取显著性上调的蛋白。通过黄颡鱼转录组和基因组数据找到相应蛋白的完整cds序列并翻译成蛋白序列。使用抗微生物序列扫描系统(ampa：http://tcoffee.crg.cat/apps/ampa/do)对完整的蛋白质序列进行预测并与质谱鉴定的肽段序列比对筛选得到数条多肽序列，并通过化学合成试验验证，ychβ对小瓜虫滋养体有较好的效果，其氨基酸序列如seqidno.1所示。该抗菌肽序列较短，可通过fmoc化学合成，合成后使用反向高效液相色谱仪进行纯化多肽，使用alltimatmc18柱(4.6×250mm)用乙腈以1ml/min的速率洗脱，其中缓冲液a是0.065％三氟乙酸(tfa)的水溶液，缓冲液b是0.05％三氟乙酸(tfa)的乙腈溶液。基于上述多肽序列(seqidno.1)通过化学合成人工多肽，纯化后的纯度高达90％，并通过质谱仪鉴定肽段序列准确性，质谱图见图1。实施例2抗菌肽ychβ对小瓜虫的防治效果1.材料与方法1.1试验鱼将严重感染小瓜虫的黄颡鱼与正常黄颡鱼(28.5±6.7g)混养于60l水箱中,接种小瓜虫。随机选取20尾，观察体表白色包囊清晰可见，试验鱼小瓜虫感染率为100％。1.2小瓜虫滋养体、包囊体和掠食体的准备当黄颡鱼被小瓜虫严重感染时(鱼体表肉眼可见许多白点)，轻轻用细胞刮刀刮取鱼体体包的白色包收集到小烧杯中，用蒸馏水反复冲洗多遍，直至大部分粘液被去除后即滋养体。将小瓜虫转移到另一个装有灭菌双蒸水的培养皿中，至于18±1℃，滋养体约1h后不再游动并固定在培养皿底部，外有一层透明的包囊膜，虫体在内部旋转运动，即可判断为包囊体。包囊体并以二分裂的形式发育，当子代虫体从8细胞期进入16细胞期时，包囊内部形成内胞膜将子代虫体分为两个集团。包囊体经过27h左右孵化，破膜而出形成掠食体游离于水中。1.3体外杀虫试验将粉末状的抗菌肽溶于灭菌双蒸水中使其终浓度为1000μg/ml，用双蒸水稀释为500、250、125、50、25、15、5、2和1μg/ml。体外试验在96孔细胞培养板中进行，每孔加入70μl不同浓度抗菌肽和10个滋养体，每种浓度3个平行孔。试验设置双蒸水作为对照组。每个半小时镜检一次，2h后统计各孔死亡情况。包囊体和掠食体的药物处理同上。小瓜虫不同阶段死亡判断标准：虫体纤毛不再运动，膜破裂，包内物质外流。2结果抗菌肽对小瓜虫的不同阶段效果作用如表1所示，ychβ对小瓜虫的三种不同生活史阶段均有效果。抗菌肽对小瓜虫的滋养体阶段作用效果由图2可知：抗菌肽对滋养体阶段的小瓜虫有较强的杀伤效果，仅需要15μg/ml处理3-5min即可完全杀灭所用孔内滋养体，导致其纤毛停止运动，细胞膜破损，胞内物质吐出。由图3a可看出包囊体有一层厚厚的包囊膜包裹虫体，用500μg/ml处理能导致包囊膜萎缩，破裂如图3b所示。对于前面2、4、8胞期的包囊体仅需要30min左右处理能导致胞内子代虫体死亡。由于16胞期及后期又形成内胞膜包裹子代虫体，所以药物较难渗透，从靠近包囊膜旁的子代虫体开始死亡至内部最后死亡，花费时间较长约2h。ychβ对小瓜虫的掠食体阶段的效果如图4所示，也能导致胞内物质外流，停止游动。所以抗菌肽ychβ具有良好的膜穿透性，能够较容易杀死滋养体和掠食体，而对于有较厚包囊膜的包囊体在较高浓度的抗菌肽ychβ处理下也可破坏包囊膜，从而导致包裹的子代虫体溶解。表1.抗菌肽对小瓜虫不同阶段生活史阶段作用pcmin(μg/ml)pc100(μg/ml)滋养体515包囊体500≥500掠食体15125pcmin为每孔至少有一个虫体死亡，pc100为孔内虫体完全死亡。序列表<110>华中农业大学<120>一种用于防治小瓜虫的抗菌肽<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>33<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1alaalalysleuglyproalaalaphethrprogluvalhisgluthr151015trpglnlyspheleuasnvalvalvalalaalaleucyslysglntyr202530his当前第1页12