检测两个单核苷酸多态性位点的多态性的成套引物及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
中检测两个单核苷酸多态性位点的多态性的成套引物及其应用。
背景技术：
：单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。线粒体dna突变是引起母系遗传非综合征型耳聋(感音神经性耳聋)的重要原因之一，这些突变主要位于线粒体的12srrna基因上，突变分析发现在线粒体12srrna上存在多个和严重的药物性耳聋相关的基因突变，其中尤以a1555g和c1494t两位点的突变在氨基糖苷类抗生素引发的耳聋病例中占有显著的比重(morton,n.e.geneticepidemiologyofhearingimpairment.annalsofthenewyorkacademyofsciences630,16-31，1991)。这两个突变在20％的氨基糖苷类耳毒性病例中被广泛发现。研究结果表明，绝大多数的a1555g和c1494t突变携带者是在使用氨基糖苷类抗生素后出现听力不可逆的损伤(li,r.etal.cosegregationofc-insertionatposition961withthea1555gmutationofthemitochondrial12srrnageneinalargechinesefamilywithmaternallyinheritedhearingloss.americanjournalofmedicalgenetics.parta124a,113-117,doi:10.1002/ajmg.a.20305，2004)。目前可能引发耳聋的氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、链霉素、卡那霉素、托普霉素等，这些都是临床上非常重要的抗生素，能够特异性地抑制好氧革兰阴性菌的生长，并能协同作用于某些特定的革兰阳性菌，氨基糖苷类抗生素以其价格低廉、抗菌谱广、杀菌作用快等特点，在临床上广泛使用，其后果是由氨基糖苷类抗生素导致的耳聋病例在耳聋人群中占有较高的比例。携带a1555g和c1494t突变的个体对氨基糖苷类抗生素高度敏感，导致临床上常见的“一针致聋”现象，是后天获得性耳聋发生的重要原因，因此，通过遗传学和分子生物学方法预测个体对氨基糖苷类抗生素的用药风险，加强氨基糖苷类抗生素用药的安全性，降低耳聋的发病率就显得尤为重要(young,w.y.etal.extremelylowpenetranceofhearinglossinfourchinesefamilieswiththemitochondrial12srrnaa1555gmutation.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications328,1244-1251,doi:10.1016/j.bbrc.2005.01.085(2005))。线粒体dna(mitochondrialdna,mtdna)上的a1555g和c1494t突变都位于高度保守的小核糖体亚基氨酰—trna结合区域(a区域)，是氨基糖苷类抗生素重要的识别区域。在人类的12srrna上，1494和1555两位点碱基位置相对，彼此间并不配对。而当1494位点的c突变为t或者1555位点的a突变为g，则两位点之间会通过氢键进行碱基配对，使得12srrna的发夹结构多出一个配对碱基，从形态上更类似于细菌的16srrna。这类由突变而成的g—c或者a—u的碱基配对在12srrna上形成了一个氨基糖苷类抗生素的结合位点(guan,m.x.molecularpathogeneticmechanismofmaternallyinheriteddeafness.annalsofthenewyorkacademyofsciences1011,259-271，2004)，促使该类药物更容易结合到12srrna上。而实验也证明，携带a1555g或c1494t突变的细胞系表现出对氨基糖苷类抗生素的高敏感性，所以携带这些突变的人在接触了氨基糖苷类抗生素时会表现出不同程度或加重耳聋症状。自1993年prezant首次证实线粒体突变存在于氨基糖苷类抗生素致聋患者中以来，发生在线粒体12srrna基因的a1555g突变被确认为是致病突变以来(prezant,t.r.etal.mitochondrialribosomalrnamutationassociatedwithbothantibiotic-inducedandnon-syndromicdeafness.naturegenetics4,289-294,doi:10.1038/ng0793-289，1993)，关于线粒体耳聋基因突变热点a1555g或c1494t的检测方法已有多种，其中包括直接测序法、酶切法、基因芯片法、实时荧光定量taqman探针法、pcr-限制性片段长度多态性(pcr-rflp)技术、荧光染料pcr法等。直接测序法虽然是鉴定突变的金标准，但该操作繁琐，费用昂贵，限制了其广泛应用；酶切鉴定虽然操作方便、结果可靠，但所用限制性内切酶普遍较贵；基因芯片法虽然可以做到高通量、数据全面，但对实验室设备、环境和操作人员要求高，且费用昂贵，难以在一般的医院或者实验室推广使用；实时荧光定量法虽可对突变进行广泛筛查，但操作依然不够简便，检测费用依然偏高。因此，迫切需要一种能够快速、简便、准确、经济的检测两个单核苷酸多态性位点的方法，以满足对mtdnaa1555g和c1494t突变位点进行广泛筛查的需要。专利号为200810223411.1的专利公布了一种利用4条引物，同时检测两个突变位点的技术方法和试剂盒。但是，该专利提供的实验方法仅应用于外周血液样本，对唾液或口腔拭子等易于获取，便于广泛筛查的样本并未提及。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何实现一次pcr反应和常规电泳技术同时对两个位点(如a位点和b位点)的4种可能基因型(a单位点突变、b单位点突变、a和b两位点均突变以及a和b两位点均不突变)进行检测，并且对外周血液、唾液、口腔拭子等样本类型均可达到理想的分型效果，增加检测的准确性和灵敏度。为了解决上述技术问题，本发明提供了检测两个单核苷酸多态性位点的多态性(即等位基因)的成套引物。本发明所提供的检测两个单核苷酸多态性位点的多态性成套引物中所述两个单核苷酸多态性位点分别为a位点和b位点，所述a位点和所述b位点位于同一条dna上，所述a位点位于所述b位点的上游；所述成套引物由名称为f1o的上游外引物、名称为ro的下游外引物、a位点突变型内引物和b位点突变型内引物组成；所述f1o是对应于所述a位点的上游区域的单链dna，进行扩增时所述f1o的延伸方向是所述a位点的下游；所述ro是对应于所述b位点的下游区域的单链dna，进行扩增时所述ro的延伸方向是所述b位点的上游；所述a位点突变型内引物是对应于所述a位点的单链dna，且所述a位点突变型内引物的3′末端核苷酸与所述a位点突变型核苷酸相同，进行扩增时所述a位点突变型内引物的延伸方向是所述a位点的下游；所述b位点突变型内引物是对应于所述b位点的单链dna，且所述b位点突变型内引物的3′末端核苷酸与所述b位点突变型核苷酸互补配对，进行扩增时所述b位点突变型内引物的延伸方向是所述b位点的上游。上述成套引物中，所述a位点和所述b位点之间可相距60-260bp，如61bp。上述成套引物中，所述a位点可为人线粒体全基因组的第1494位和所述b位点为人线粒体全基因组的第1555位(分别对应于genbankaccessionno.nc_012920(updatedate31-oct-2014)的第1494位和第1555位)。genbankaccessionno.nc_012920(updatedate31-oct-2014)是人线粒体全基因组序列，第1494位和第1555位均是野生型，第1494位核苷酸是c，第1555位核苷酸是a。上述成套引物中，所述f1o、所述ro、所述a位点突变型内引物和所述b位点突变型内引物之间的摩尔比可为1∶1∶2∶2。含有上述成套引物的检测两个单核苷酸多态性位点的多态性的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。上述试剂或试剂盒还可包括用作质控的a位点野生型和b位点野生型重组载体、a位点突变型重组载体和b位点突变型重组载体。上述试剂或试剂盒中，所述a位点野生型和b位点野生型重组载体中含有包括所述a位点和所述b位点在内的来源于动物的dna片段，且所述a位点和所述b位点均为野生型核苷酸；所述a位点突变型重组载体与所述a位点野生型和b位点野生型重组载体的区别仅在于所述a位点为突变型核苷酸；所述b位点突变型重组载体与所述a位点野生型和b位点野生型重组载体的区别仅在于所述b位点为突变型核苷酸。上述试剂或试剂盒还可包括进行pcr扩增所需的其它试剂。上述成套引物、试剂或试剂盒可以以动物的外周血液、唾液或口腔拭子作为待检测样本。上述成套引物在制备检测人基因组中两个单核苷酸多态性位点的试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。上述成套引物或所述试剂或试剂盒在检测人基因组中两个单核苷酸多态性位点中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，包括对待检测样本进行pcr扩增反应的步骤；所述pcr扩增反应采用的引物退火条件可为先进行如下10个循环：95℃30s，退火温度30s，72℃30s，其中，退火温度从65℃开始至56℃截止，每个循环退火温度降低1℃；再进行如下25个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；所述待检测样本可为外周血液、唾液或口腔拭子。上述应用中，所述pcr扩增反应采用的pcr反应温度程序具体可为：先95℃5min；然后进行如下10个循环：95℃30s，退火温度30s，72℃30s，其中退火温度从65℃开始每个循环退火温度降低1℃，也就是第一个循环的退火温度是65℃，第10个循环的退火温度是56℃；再进行如下25个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；再72℃7min；最后4℃保持。本发明中所述动物可为哺乳动物，如人。上述应用是非疾病诊断目的、非疾病预防目的和/或非疾病治疗目的，其直接目的不是获取疾病诊断结果或健康状况，而是获取中间结果。本申请的发明人在引物设计过程中，巧妙地将a位点作为上游突变内引物的对应位点，b位点作为下游突变内引物的对应位点，当样本的两位点均为突变型或野生型时，仅通过查看两引物之间条带的有无即可确定这两种基因型，从而简化了从实验结果到基因型判断的过程，进一步加快了整个实验进程，使两个snp位点突变的大规模筛查或预防性检查更易于推广和实现。在实施例中，本申请的发明人针对目前检测a1555g和c1494t突变的方法存在的缺陷，基于错配技术对单核苷酸多态性(snp)进行分型的原理，仅使用四条引物，一次pcr反应，最终实现一次pcr反应和常规电泳技术同时对个体两个位点的4种可能基因型(a1555g单位点突变、c1494t单位点突变、两位点均突变的双突变型和两位点均不突变的野生型)进行检测，不仅克服了错配技术一次只能检测一个位点的缺陷，而且该实验方法对于外周血液、唾液、口腔拭子等样本类型均可达到理想的分型效果，大大简化了整个实验的流程，增加了检测的准确性和灵敏度，从而实现了对a1555g和c1494t两位点基因型快速、简便、准确、经济的检测。附图说明图1为检测人线粒体全基因组的第1494位和第1555位的多态性的引物设计图示。图2为人线粒体全基因组的第1494位和1555位纯合的野生型阴性对照质粒pt-1494-c-1555-a(野生型对照质粒)以及1494位和1555位的单位点突变型阳性对照质粒pt-1494-t(1494-t突变型质粒)和pt-1555-g(1555-g突变型质粒)测序结果。图3为口腔拭子样本测序结果。图4为利用成套引物f1o/ro+内引物检测质控质粒和口腔拭子样本的电泳图谱。图中，1494m表示样本为pt-1494-t，1555m表示样本为pt-1555-g，wt表示样本为pt-1494-c-1555-a，ntc表示样本为无核酸酶水，s1表示样本为口腔拭子样本s1，s2表示样本为口腔拭子样本s2，s3表示样本为口腔拭子样本s3，s4表示样本为口腔拭子样本s4，d2000表示分子量标准d2000。图5为利用成套引物f2o/ro+内引物检测质控质粒和口腔拭子样本的电泳图谱。图中，1494m表示样本为pt-1494-t，1555m表示样本为pt-1555-g，wt表示样本为pt-1494-c-1555-a，ntc表示样本为无核酸酶水，s1表示样本为口腔拭子样本s1，s2表示样本为口腔拭子样本s2，s3表示样本为口腔拭子样本s3，s4表示样本为口腔拭子样本s4，d2000表示分子量标准d2000。图6为200810223411.1方法和本发明方法检测口腔拭子样本的电泳图谱。图中，1-40为口腔拭子样本编号，1494m表示样本为pt-1494-t，1555m表示样本为pt-1555-g，wt表示样本为pt-1494-c-1555-a，ntc表示样本为无核酸酶水，s1表示样本为口腔拭子样本s1，s2表示样本为口腔拭子样本s2，s3表示样本为口腔拭子样本s3，s4表示样本为口腔拭子样本s4，d2000m表示分子量标准d2000。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面以人线粒体全基因组的第1494位为a位点和人线粒体全基因组的第1555位为b位点，来阐明本发明的检测两个单核苷酸多态性位点的多态性的成套引物及方法。人线粒体全基因组的第1494位和人线粒体全基因组的第1555位分别对应于genbankaccessionno.nc_012920(updatedate31-oct-2014)的第1494位和第1555位。genbankaccessionno.nc_012920(updatedate31-oct-2014)是人线粒体全基因组序列，第1494位和第1555位均是野生型，第1494位核苷酸是c，第1555位核苷酸是a。本申请的发明人采用200810223411.1的实验方法对人线粒体全基因组的第1494位和第1555位已知基因型的大量口腔拭子及唾液样本dna(232个)进行检测后，发现该方法不仅存在非特异条带的干扰，而且出现了高达74％的假阳性率，出现这样结果的原因有可能是对样本类型要求较高——外周血样本，这样不仅取样繁琐，额外消耗时间成本和经济成本，在大规模突变筛查中也难以得到广泛推广和应用。本申请的发明人针对目前检测a1555g和c1494t突变的方法存在的缺陷，基于错配技术对单核苷酸多态性(snp)进行分型的原理，仅使用四条引物，一次pcr反应，最终实现一次pcr反应和常规电泳技术同时对个体两个位点的4种可能基因型(a1555g单位点突变、c1494t单位点突变、两位点均突变的双突变型和两位点均不突变的野生型)进行检测，不仅克服了错配技术一次只能检测一个位点的缺陷，而且该实验方法对于外周血液、唾液、口腔拭子等样本类型均可达到理想的分型效果，大大简化了整个实验的流程，增加了检测的准确性和灵敏度，从而实现了对a1555g和c1494t两位点基因型快速、简便、准确、经济的检测。在引物设计过程中，本申请的发明人巧妙地将c1494t作为上游突变内引物的对应位点，a1555g作为下游突变内引物的对应位点，当样本的两位点均为突变型或野生型时，仅通过查看两引物之间条带的有无即可确定这两种基因型，从而简化了从实验结果到基因型判断的过程，进一步加快了整个实验进程，使对线粒体基因c1494t和a1555g两位点突变的大规模筛查或预防性检查更易于推广和实现。通过对a1555g单位点突变、c1494t单位点突变及两位点均不突变(野生型)的阳性对照质粒进行构建后，以其作为阳性参照品，对实验结果进行优化。以此方法优化后的实验条件可避免大样本实验过程中假阳性或假阴性实验结果的产生，使实验结果准确可靠。实施例1、检测人线粒体全基因组的第1494位和第1555位的多态性成套引物的确立1、检测人线粒体全基因组的第1494位和第1555位的多态性成套引物的设计根据genbankaccessionno.nc_012920(updatedate31-oct-2014)所示的人线粒体全基因组(简称线粒体基因组)序列，参考四引物扩增受阻突变体系pcr(tetra-primeramplificationrefractorymutationsystempcr,arms-pcr)的引物设计原则，首先根据经验人工设计引物，之后通过primerprimier5及oligo7引物设计软件对选取的引物进行评估，最终，挑选出评分较高的引物作为备选。最终挑选出的引物为：在距离第1494位和第1555位两位点不同长度上下游位置的两条上游外引物(1494-1555-f1o/f2o)、一条下游外引物(1494-1555-ro)、分别针对c1494t和a1555g位点的突变型的内引物(1494-fi-t/1555-ri-g)，共5条引物，各引物对应位置如图1所示，具体引物信息如下：1.1外引物组：上游外引物1494-1555-f1o，位于线粒体基因组核苷酸的1411-1431位，序列为5’-ggtcgaaggtggatttagcag-3’(seqidno.1)；上游外引物1494-1555-f2o，位于线粒体基因组核苷酸的1439–1462位，序列为5’-agagtagagtgcttagttgaacag-3’；下游外引物1494-1555-ro，位于线粒体基因组核苷酸1727–1703位的互补序列，序列为5’-tggtttggctaaggttgtctggtag-3’(seqidno.2)；1.2突变型内引物组：c1494t位点的突变型内引物1494-fi-t，位于线粒体基因组核苷酸的1477–1494位，序列为5’-tacacaccgcccgtctct-3’(seqidno.3)，其中，1492位的a替换为t，1494位的c由t替换；a1555g位点的突变型内引物1555-ri-g，位于线粒体基因组核苷酸1579–1555位的互补序列，其中，1557位的t由a置换，1555位的t由c替换，序列为5’-gtacacttaccatgttacgactagc-3’(seqidno.4)。上述5条引物构成两个成套引物：f1o/ro+内引物和f2o/ro+内引物。f1o/ro+内引物由1494-1555-f1o、1494-1555-ro、1494-fi-t和1555-ri-g组成。f2o/ro+内引物由1494-1555-f2o、1494-1555-ro、1494-fi-t和1555-ri-g组成。f1o/ro+内引物和f2o/ro+内引物对不同基因型样本对应条带个数及大小如表1所示。表1.不同基因型样本对应条带个数及大小样本的基因型条带个数f1o/ro+内引物f2o/ro+内引物野生型1317bp289bp1555突变2317bp/169bp289bp/141bp1494突变2317bp/251bp289bp/251bp双突变4317bp/251bp/169bp/103bp289bp/251bp/141bp/103bp2、阳性及阴性对照质粒构建以包含人线粒体全基因组的第1494位和第1555位(分别简称1494位和1555位)这两个位点的线粒体dna核苷酸序列(seqidno.5，即genbankaccessionno.nc_012920(updatedate31-oct-2014)的第1026-1761位)作为模板，另外设计2条外引物，对目的片段进行pcr扩增，将扩增产物克隆到t载体(promega，pgemr-t载体系统ii，cat.#a3610)构建野生型的环形重组质粒，得到含有核苷酸序列是seqidno.5的dna的重组载体，将其命名为pt-1494-c-1555-a。另外于1494位和1555位两位点处分别设计2条在突变点存在重合区域的正反向引物(1494-mut-f/1494-mut-r、1555-mut-f/1555-mut-r)，以pt-1494-c-1555-a为模板，利用点突变质粒构建试剂盒(全式金，fastmutagenesissystem，cat.#fm111)的pcr实验体系，进行pcr扩增，利用dpni酶(thermofisher，#fd1724)降解扩增产物中的非突变型质粒模板，从而有效地筛选突变克隆。将含有第1494位是t的dna片段(将该dna片段命名为dna片段1494-t)的重组载体命名为pt-1494-t。dna片段1494-t的核苷酸序列是将seqidno.5的第469位的c替换为t，其它核苷酸均不变得到的dna片段。seqidno.5的第469位对应genbankaccessionno.nc_012920(updatedate31-oct-2014)的第1494位。将含有第1555位是g的dna片段(将该dna片段命名为dna片段1555-g)的重组载体命名为pt-1555-g。dna片段1555-g的核苷酸序列是将seqidno.5的第530位的a替换为g，其它核苷酸均不变得到的dna片段。seqidno.5的第530位对应genbankaccessionno.nc_012920(updatedate31-oct-2014)的第1555位。1494-mut-f:5’-gcccgtcactctcctcaag-3’1494-mut-r:5’-agtgacgggcggtgtgtac-3’1555-mut-f:5’-atagaggaggcaagtcgtaac-3’1555-mut-r:5’-cctcctctatataaatgcgtag-3’最后，经测序确认(图2)，得到1494位和1555位纯合的野生型阴性对照质粒pt-1494-c-1555-a(图2中野生型对照质粒)以及1494位和1555位的单位点突变型阳性对照质粒pt-1494-t(图2中1494-t突变型质粒)和pt-1555-g(图2中1555-g突变型质粒)，可用来作为本实验优化过程中的各基因型目标条带的对照。pt-1494-t在下文中又称1494m阳性对照质粒，简称1494m；pt-1555-g在下文中又称1555m阳性对照质粒，简称1555m；pt-1494-c-1555-a在下文中又称野生型阴性对照质粒，简称wt。3、上游外引物的确定为方便后续实验的进行，首先根据以往pcr实验优化经验进行实验，从挑选出的两条上游外引物1494-1555-f1o和1494-1555-f2o中确定一条较好的引物，作为后续实验条件优化的上游外引物。3.1实验样本实验样本选取1494位和1555位单位点突变型阳性对照质粒(pt-1494-t和pt-1555-g)、纯合的野生型阴性对照质粒(pt-1494-c-1555-a)、经sanger测序确认为野生型的3个口腔拭子样本(s1、s2、s3)和1个1555位杂合型而1494野生型的口腔拭子样本(s4)，以及无核酸酶水作为无模板对照(ntc)，其中，4个口腔拭子样本sanger测序结果如图3：s1、s2、s3基因型均为1494-cc和1555-aa，s4基因型为1494-cc和1555-ag。基因组dna提取：每个口腔拭子样本，使用磁珠法口腔拭子基因组dna提取试剂盒(tiangen，cat.#dp703)进行基因组dna的提取，提取后使用qubit2.0测定dna的浓度，-20℃保存，备用。3.2pcr扩增反应程序由于本实验中各pcr扩增体系中会同时加入4条引物，为简化实验优化过程中退火温度的确定，决定采用touch-downpcr进行实验。将评估后挑选出的引物按照结合后可产生有效基因型识别条带的引物对进行两两组合，使用在线tm值计算软件(thermofisherscientific>tmcalculator)，对每对引物的tm值进行计算，挑选出最高和最低的温度作为touch-downpcr温度范围的参考，经过优化，最终确定pcr扩增反应程序如下：先95℃5min；然后进行如下10个循环：95℃30s，退火温度30s，72℃30s，其中退火温度从65℃开始每个循环退火温度降低1℃，也就是第一个循环的退火温度是65℃，第10个循环的退火温度是56℃；再进行如下25个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；再72℃7min，4℃保持。3.3pcr扩增体系采用成套引物f1o/ro+内引物的如下8个pcr扩增体系：f1o外引物+1494mpcr体系、f1o外引物+1555mpcr体系、f1o外引物+wtpcr体系、f1o外引物+s1pcr体系、f1o外引物+s2pcr体系、f1o外引物+s3pcr体系、f1o外引物+s4pcr体系、f1o外引物+ntcpcr体系。采用成套引物f2o/ro+内引物的如下8个pcr扩增体系：f2o外引物+1494mpcr体系、f2o外引物+1555mpcr体系、f2o外引物+wtpcr体系、f2o外引物+s1pcr体系、f2o外引物+s2pcr体系、f2o外引物+s3pcr体系、f2o外引物+s4pcr体系、f2o外引物+ntcpcr体系。3.3.1f1o外引物+1494mpcr体系f1o外引物+1494mpcr体系组成为：1494m1μl(103拷贝/μl)，2×taqmastermix(dye)12.5μl，1494-1555-f1o0.5μl(10μm)，1494-1555-ro0.5μl(10μm)，1494-fi-t1μl(10μm),1555-ri-g1μl(10μm),无核酸酶水8.5μl。3.3.2f1o外引物+1555mpcr体系f1o外引物+1555mpcr体系除将f1o外引物+1494mpcr体系中的1494m替换为1555m外，其它均与f1o外引物+1494mpcr体系相同。3.3.3f1o外引物+wtpcr体系f1o外引物+wtpcr体系除将f1o外引物+1494mpcr体系中的1494m替换为wt外，其它均与f1o外引物+1494mpcr体系相同。3.3.4f1o外引物+s1pcr体系f1o外引物+s1pcr体系除将f1o外引物+1494mpcr体系中的1494m1μl(103拷贝/μl)替换为s1基因组dna1μl(10ng/μl)外，其它均与f1o外引物+1494mpcr体系相同。3.3.5f1o外引物+s2pcr体系f1o外引物+s2pcr体系除将f1o外引物+s1pcr体系中的s1基因组dna替换为s2基因组dna外，其它均与f1o外引物+s1pcr体系相同。3.3.6f1o外引物+s3pcr体系f1o外引物+s3pcr体系除将f1o外引物+s1pcr体系中的s1基因组dna替换为s3基因组dna外，其它均与f1o外引物+s1pcr体系相同。3.3.7f1o外引物+s4pcr体系f1o外引物+s4pcr体系除将f1o外引物+s1pcr体系中的s1基因组dna替换为s4基因组dna外，其它均与f1o外引物+s1pcr体系相同。3.3.8f1o外引物+ntcpcr体系f1o外引物+ntcpcr体系除将f1o外引物+1494mpcr体系中的1494m1μl(103拷贝/μl)替换为1μl无核酸酶水外，其它均与f1o外引物+s1pcr体系相同。3.3.9f2o外引物+1494mpcr体系f2o外引物+1494mpcr体系除将f1o外引物+1494mpcr体系中的f1o外引物替换为f2o外引物外，其它均与f1o外引物+1494mpcr体系相同。3.3.10f2o外引物+1555mpcr体系f2o外引物+1555mpcr体系除将f1o外引物+1555mpcr体系中的f1o外引物替换为f2o外引物外，其它均与f2o外引物+1555mpcr体系相同。3.3.11f2o外引物+wtpcr体系f2o外引物+wtpcr体系除将f1o外引物+wtpcr体系中的f1o外引物替换为f2o外引物外，其它均与f1o外引物+wtpcr体系相同。3.3.12f2o外引物+s1pcr体系f2o外引物+s1pcr体系除将f1o外引物+s1pcr体系中的f1o外引物替换为f2o外引物外，其它均与f1o外引物+s1pcr体系相同。3.3.13f2o外引物+s2pcr体系f2o外引物+s2pcr体系除将f1o外引物+s2pcr体系中的f1o外引物替换为f2o外引物外，其它均与f1o外引物+s2pcr体系相同。3.3.14f2o外引物+s3pcr体系f2o外引物+s3pcr体系除将f1o外引物+s3pcr体系中的f1o外引物替换为f2o外引物外，其它均与f1o外引物+s3pcr体系相同。3.3.15f2o外引物+s4pcr体系f2o外引物+s4pcr体系除将f1o外引物+s4pcr体系中的f1o外引物替换为f2o外引物外，其它均与f1o外引物+s4pcr体系相同。3.3.16f2o外引物+ntcpcr体系f2o外引物+ntcpcr体系除将f1o外引物+ntcpcr体系中的f1o外引物替换为f2o外引物外，其它均与f1o外引物+ntcpcr体系相同。3.4电泳检测配制3％(w/v)的琼脂糖核酸胶，1×tae电泳液，120v电压，上样量5μl，跑胶1h，紫外照射后拍照分析结果，以d2000marker(tiangen，cat.#md114)作为条带大小判断标准。结果如图4和图5，参照表1的基因型判断表可看出，含有1494-1555-f1o的成套引物f1o/ro+内引物不但在野生型对照质粒(wt)中仅能扩增出一条317bp的条带，在1494m阳性对照质粒(1494m)中仅能扩增出一条317bp的条带和一条251bp的条带，在1555m阳性对照质粒(1555m)中仅能扩增出一条317bp的条带和一条169bp的条带，还可对野生型口腔拭子样本s1、s2、s3(仅出现317bp一条带)和1555杂合口腔拭子样本s4仅出现317bp和169bp两条带)进行正确分型。相比之下，含有1494-1555-f2o的成套引物f2o/ro+内引物不能区分野生型对照质粒(wt)和1494m阳性对照质粒(1494m)，均出现了一条289bp的条带和一条251bp的条带，野生型对照质粒(wt)中不该出现251bp的条带，因此舍弃该引物不用，在后续的实验中，选用1494-1555-f1o作为上游外引物，将含有1494-1555-f1o的成套引物f1o/ro+内引物作为本发明保护的成套引物。本实施例提供的检测人线粒体全基因组的第1494位和第1555位的多态性成套引物是成套引物f1o/ro+内引物。成套引物f1o/ro+内引物由1494-1555-f1o、1494-1555-ro、1494-fi-t和1555-ri-g组成。1494-1555-f1o是核苷酸序列是seqidno.1的单链dna，1494-1555-ro是核苷酸序列是seqidno.2的单链dna，1494-fi-t是核苷酸序列是seqidno.3的单链dna，1555-ri-g是核苷酸序列是seqidno.4的单链dna。成套引物f1o/ro+内引物中，1494-1555-f1o、1494-1555-ro、1494-fi-t和1555-ri-g的摩尔比是1∶1∶2∶2。实施例2、检测人线粒体全基因组的第1494位和第1555位的多态性(基因分型检测)对已知基因型(经sanger测序)的144个口腔拭子或88个唾液样本共计232个样本分别提取基因组dna，同时采用专利200810223411.1中实施例2的方法(以下简称200810223411.1方法)和本发明方法进行检测，并以实施例1的1494m、1555m、wt、s1、s2、s3、s4和ntc作为对照。232个样本的信息如表2所示，编号为1至88的样本为口腔拭子样本，编号为89至232的样本为唾液样本；共计230个野生型样本(人线粒体全基因组的第1494位为c和第1555位为a)，2个1555位突变型样本(人线粒体全基因组的第1494位为c和第1555位为a和g的杂合性)。1、200810223411.1方法1.1200810223411.1方法200810223411.1方法除将专利200810223411.1中实施例2的方法中的样本替换为上述样本外，其它与专利200810223411.1中实施例2的方法相同。1.2基因型判定标准200810223411.1方法的基因型判定标准是电泳条带为一条736bp的条带为野生型(人线粒体全基因组的第1494位为c和第1555位为a)，电泳条带为一条226bp的条带和一条736bp的条带为1555位突变型(人线粒体全基因组的第1494位为c和第1555位为a和g的杂合性，或人线粒体全基因组的第1494位为c和第1555位为g)，电泳条带为一条488bp的条带和一条736bp的条带和一条错误引发条带为1494位突变型(人线粒体全基因组的第1494位为t和第1555位为a，或人线粒体全基因组的第1494位为t和c的杂合型和第1555位为a)。2、本发明方法2.1、样本的pcr体系样本的pcr体系组成为：基因组dna1μl(10ng/μl)，2×taqmastermix(dye)12.5μl，1494-1555-f1o0.5μl(10μm)，1494-1555-ro0.5μl(10μm)，1494-fi-t1μl(10μm),1555-ri-g1μl(10μm),无核酸酶水8.5μl。1494m的pcr体系组成同实施例1的f1o外引物+1494mpcr体系，1555m的pcr体系组成同实施例1的f1o外引物+1555mpcr体系，wt的pcr体系组成同实施例1的f1o外引物+wtpcr体系，s1的pcr体系组成同实施例1的f1o外引物+s1pcr体系，s2的pcr体系组成同实施例1的f1o外引物+s2pcr体系，s3的pcr体系组成同实施例1的f1o外引物+s3pcr体系，s4的pcr体系组成同实施例1的f1o外引物+s4pcr体系，ntc的pcr体系组成同实施例1的f1o外引物+ntcpcr体系。2.2、pcr扩增反应程序如下：先95℃5min；然后进行如下10个循环：95℃30s，退火温度30s，72℃30s，其中退火温度从65℃开始每个循环退火温度降低1℃，也就是第一个循环的退火温度是65℃，第10个循环的退火温度是56℃；再进行如下25个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；再72℃7min，4℃保存。2.3、电泳检测配制3％(w/v)的琼脂糖核酸胶，1×tae电泳液，120v电压，上样量5μl，跑胶1h，紫外照射后拍照分析结果，以d2000marker(tiangen，cat.#md114)作为条带大小判断标准。2.4、基因型判定标准电泳条带为一条317bp的条带为野生型(人线粒体全基因组的第1494位为c和第1555位为a)，电泳条带为一条317bp的条带和一条169bp的条带为1555位突变型(人线粒体全基因组的第1494位为c和第1555位为a和g的杂合性，或人线粒体全基因组的第1494位为c和第1555位为g)，电泳条带为一条317bp的条带和一条251bp的条带为1494位突变型(人线粒体全基因组的第1494位为t和第1555位为a，或人线粒体全基因组的第1494位为t和c的杂合型和第1555位为a)。232个口腔拭子及唾液样本的检测结果如表2所示，表明200810223411.1方法在171个野生型样本中出现了不应该出现的226bp条带，误将74％的野生型样本鉴定为1555位点是g的突变型(纯合型或杂合型)，并且有的野生型样本无法正确检测(如第6、62和185号样本没有出现应该出现的736bp的条带)。说明200810223411.1方法对于口腔拭子及唾液样本的野生型样本的检测出现了大量的与目标分型条带处于同一水平的非特异扩增条带(226bp)，严重影响分型结果的判读，造成结果假阳性率极高，出现了高达74％的假阳性率。而本发明方法均可对232个口腔拭子及唾液样本进行完美分型，不存在假阳性结果的存在，准确率为100％。图6给出了编号为1-40的口腔拭子样本的检测结果。由于在引物设计过程中，发明人巧妙地将a1555g作为下游突变内引物，c1494t作为上游突变内引物，当样本的两位点均为突变型或野生型时，仅通过查看两引物之间条带(103bp)的有无即可确定这两种基因型，另外，103bp条带还可与169bp和251bp条带相互佐证，以免出现基因型的误判。因此相比于专利200810223411.1只有两条特异性条带均出现，才能正确判断野生型或双突变型，一旦某个条带由于扩增质量的好坏被弱化，极易造成假阳性或假阴性结果的产生。表2、200810223411.1方法和本发明方法检测结果比较由于a1555g和c1494t两位点的突变均可导致对氨基糖苷类抗生素高度敏感，使个体致聋风险增加，因此只要检测出个体为a1555g和c1494t两位点突变的携带者(包括杂合突变和纯合突变)，即可说明其致聋风险较大，因此无需突变型内引物组合野生型内引物组同时检测来确定结果，只需突变型内引物组的4条引物，一个pcr反应，即可确定个体是否为a1555g和c1494t两位点突变的携带者。本发明不仅所构建的质粒样本可作为对照指示各基因型的正确目标条带，且提取的口腔拭子或唾液样本基因组dna均可正确分型，克服了以往方法的假阳性问题，由于口腔拭子或唾液样本相较外周血样本具有采样简单、易于获取的优势，使得本检测方法拓宽了样本检测的范围。另外由于引物设计的创新性，两内引物之间条带(103bp)的扩增可与两条单位点突变条带(251bp和169bp)相互佐证，轻易判断出野生型或双位点突变的样本。真正实现了对线粒体母系遗传性耳聋基因a1555g和c1494t两位点基因型快速、简便、准确、经济的检测，使对线粒体基因c1494t和a1555g两位点突变的大规模筛查或预防性检查更易于推广和实现。以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。<110>北京东方亚美基因科技研究院有限公司<120>检测两个单核苷酸多态性位点的多态性的成套引物及其应用<130>gncfh181759<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggtcgaaggtggatttagcag21<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tggtttggctaaggttgtctggtag25<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tacacaccgcccgtctct18<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtacacttaccatgttacgactagc25<210>5<211>736<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactgggattagataccc60cactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaaaactgctcgccagaacacta120cgagccacagcttaaaactcaaaggacctggcggtgcttcatatccctctagaggagcct180gttctgtaatcgataaaccccgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatataccgcc240atcttcagcaaaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaagacgtt300aggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctaccccagaaaac360tacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatttagcagtaaactaagagtag420agtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcaccctcctcaagta480tacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggagacaagtcgtaa540catggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagca600cccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaaacctagcccc660aaacccactccaccttactaccagacaaccttagccaaaccatttacccaaataaagtat720aggcgatagaaattga736当前第1页12