一种极端酸、碱水解法在芽孢杆菌发酵油料粕生产伊枯草菌素A中的应用及其方法与流程

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种极端酸、碱水解法在芽孢杆菌发酵油料粕生产伊枯草菌素a中的应用及其方法。

背景技术：

伊枯草菌素a(iturina)是芽孢杆菌合成脂肽之一，它具有抑制癌症、溶血、表面活性和强烈抗真菌等特性，并且具有抗菌谱广、低毒、过敏反应小等特点，是一种具有巨大应用潜力的抗真菌制剂，可广泛用于防治各种作物、蔬菜和瓜果的真菌病害，具有稳定性好、抑菌持久、不易产生抗药性和对环境安全等优点，是一种极具研究开发价值和应用前景的新型生物农药，近年来受到国内外广泛关注。但是，迄今为止，国内外仍没有可行的iturina发酵生产方法，其产量低、成本高，发酵工艺控制难度大，制约着其工业化生产和商业化应用。若能降低iturina的生产成本，使其具有与化学农药相竞争的能力，其农业化应用将有望在未来几十年急剧增长。

近年来，越来越多与微生物发酵相关的产业开始兴盛起来，而在进行微生物发酵之前往往需要进行高温灭菌，这往往需要消耗大量的能源，除了会造成生产时间、成本增加和环境污染以外，在高温灭菌的过程中还会使原料的性质和结构发生不利的改变，如蛋白变性等，进而影响微生物发酵，所以使用能够替代高温灭菌的方法对于微生物发酵相关的产业具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种极端酸、碱水解法在芽孢杆菌发酵油料粕生产伊枯草菌素a中的应用，通过在发酵之前向培养基中加入适量的盐酸或者氢氧化钠，使培养基处于极端酸、碱环境中，然后进行水解，进而达到替代或者更优于高温灭菌的效果，使芽孢杆菌发酵产iturina的量达到更高，不仅能节省大量能源、同时还能够降低发酵成本和时间，减少环境污染。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一种极端酸、碱水解法在芽孢杆菌发酵油料粕生产伊枯草菌素a中的应用，所述应用的方法如下：向含有油料粕、碳源和水的培养基中添加适量的酸或者碱，然后水解；接着利用酸或碱将培养基的ph回调为中性，接入解淀粉芽孢杆菌cx-20，经过发酵后，得到伊枯草菌素a。其中，解淀粉芽孢杆菌cx-20已于2018年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中，简称cctcc，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno：m2018794。

按上述方案，所述培养基中油料粕的浓度为30-150g/l。

按上述方案，所述碳源可以为葡萄糖、糖蜜、甘油、蔗糖或者玉米淀粉等，培养基中碳源的浓度为60-80g/l。

按上述方案，所述培养基中酸的浓度以h^+-计为0.1-0.4mol/l，优选浓度为0.2-0.4mol/l；或者，所述培养基中碱的浓度以oh^-计为0.2-0.4mol/l，最适浓度为0.2mol/l。

按上述方案，所述的酸主要选自盐酸、硫酸、硝酸等无机酸；所述的碱主要选自氢氧化钠、氢氧化钾等无机碱。

按上述方案，所述水解温度40-60℃，水解时间1-3h。最优选，在55℃水解2小时。

按上述方案，所述解淀粉芽孢杆菌cx-20的接入量为回调为中性的水解液体积的2-10％。

按上述方案，所述发酵温度28-37℃，发酵时间60-84h。最优选，所述发酵的时间为72h，所述发酵的温度为28℃。

按上述方案，所述的油料粕主要包括菜粕、豆粕或者花生粕等。

本发明的主要技术构思为：任何微生物的发酵都会受到其它杂菌的影响，因此需要进行灭菌。最常用的高温灭菌往往需要消耗大量的能源，除了会造成生产时间、成本增加和环境污染以外，在高温灭菌的过程中还会使原料的性质和结构发生改变，如蛋白变性等，进而影响微生物发酵。极端酸、碱条件的确可以杀死大多数微生物，但是在回调ph时会使培养基中的盐浓度增加，而培养基中的盐浓度会对微生物的生长和代谢具有显著的影响，所以极端酸、碱水解方法并不适用于所有微生物发酵。而相对于大多数微生物而言，解淀粉芽孢杆菌对培养基中盐浓度变化的耐受能力更强，且利用极端酸、碱对油料粕进行水解之后，更有利于芽孢杆菌利用其中的营养物质，产生更多的iturina。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所提供的一种替代高温灭菌的极端酸、碱水解方法在芽孢杆菌发酵油料粕产iturina的应用，该方法通过在发酵之前向培养基中加入适量的盐酸或者氢氧化钠，使培养基处于极端酸、碱环境中，然后进行水解，进而达到替代高温灭菌的灭菌效果，不仅能节省大量能源、同时还能够降低发酵成本和时间，减少环境污染；而且，油料粕经过酸、碱水解处理以后，能够使油料粕的物理和化学结构发生改变，更有利于解淀粉芽孢杆菌为cx-20对其中营养物质的分解和利用。另外，以油菜饼粕等农副产物为原料发酵生产iturina，能够显著降低iturina的生产成本，更有利于iturina的产业化和应用。

附图说明

图1是在培养基中不同浓度盐酸或氢氧化钠的条件下，经过55℃水解2小时后回调ph实现灭菌的条件下，利用解淀粉芽孢杆菌cx-20发酵72小时后所产iturina的含量变化，其中control为对菜粕培养基进行高温灭菌后所得到的iturina发酵结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中，所采用的菌株cx-20已于2018年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中，简称cctcc，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno：m2018794。

实施例

一种极端酸、碱水解法在芽孢杆菌发酵菜粕生产伊枯草菌素a中的应用，所述应用方法如下：将菜粕(90g/l)、葡萄糖(80g/l)和水按照比例进行混合作为培养基，向培养基中加入适量的盐酸或者氢氧化钠控制培养基中盐酸或氢氧化钠的浓度在0.1-0.4mol/l，使培养基处于极端酸、碱环境中，然后在55℃、150rpm/min的条件下水解2小时；然后分别利用氢氧化钠或者盐酸将ph调到7；按照5％的接种量接入解淀粉芽孢杆菌cx-20，发酵72小时，测定产iturina的含量，如图1所示。

对照例

采用含有相同组分、且经过高温灭菌(121℃灭菌20分钟)的培养基，按照5％的接种量接入解淀粉芽孢杆菌cx-20，发酵72小时，测定产iturina的含量。如图1中control所示。

由图1可知，如对照例所述，菜粕培养基正常的ph为7，在进行高温灭菌后发酵，iturina的产量能达到1.25g/l；而如实施例所述，当培养基中盐酸的浓度到达0.2-0.4mol/l时，iturina的产量达到了1.35g/l左右，产量提高了8.0％-8.7％，而显然盐酸的最适浓度为0.2mol/l；当培养基中氢氧化钠的浓度到达0.2mol/l时，iturina的产量达到了最高，为1.53g/l，相对于对照例提高了22.1％，而当氢氧化钠的浓度增加或者降低时，iturina的产量都会降低，且低于对照例。因此，适当的酸、碱浓度能恰当的改变油料粕的物理和化学结构，更利于解淀粉芽孢杆菌cx-20水解、吸收和利用，而当酸、碱浓度浓度过高或者过低时反而会造成不利的影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。