本发明涉及一种基于滚环扩增和dna折纸术检测micrornas的方法，具体涉及一种以滚环扩增放大靶标信号，同时利用dna折纸术引入并有序排列检测单元，从而实现对核酸分子的检测。本发明属于纳米生物传感领域。
背景技术：
micrornas（mirnas）是一组内源性的含有19~25个碱基的不翻译任何蛋白或多糖的单链小rna分子。研究表明，mirnas也可以激活靶标基因的表达。调节个体生长、发育、疾病等生理过程相关基因的表达，在生命过程中其中起重要作用的，如造血、个体早期发育、细胞增殖和凋亡、细胞分化、细胞死亡以及激素和脂肪代谢。近几年来mirnas与肿瘤之间的密切关系引起研究人员的关注。超过50%的mirnas位于dna的不稳定区域，而这些区域与肿瘤细胞染色体的剪切或扩增息息相关。mirnas在癌症发生时起着抑癌基因或致癌基因的功能，并且mirnas在许多癌症肿瘤中不正常表，这表明mirnas的表达水平对肿瘤诊断和预后具有十分重要的意义。
滚环扩增（rollingcircleamplification，rca）是以环状dna分子为模板，以短的与环dna互补或部分互补的dna或rna为引物，在phi29dna聚合酶的催化下，合成一条带有大量重复序列的很长的dna单链的核酸扩增方法，同时它也是一种恒温的核酸扩增方法，不需要高温变性的过程。其中，环dna的合成方法为本领域常规的合成方法，或选择的方法参考2015年2月19日发表在angewandtechemie中第127卷第8期题目为growthandorigamifoldingofdnaonnanoparticlesforhigh-efficiencymoleculartransportincellularimaginganddrugdelivery的论文的supportingonlineinformation第1页中所记载的方法。
dna折纸术可以利用数百条互补的短ss-dna（订书钉链），在高阳离子浓度下，将一条7308个碱基的长ss-dna（脚手架链）折叠为任意图案。而滚环扩增所得到的长的单链dna是很好的进行dna折纸的模板。由于滚环扩增所得长链携带大量重复序列，因此又可以进一步减少订书钉链的使用。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种基于滚环扩增和dna折纸术检测mirnas的方法。
本发明目的通过下述方案实现：一种基于滚环扩增和dna折纸术检测mirnas的方法，利用滚环扩增对所检测核酸进行信号放大，随后利用dna折纸术对扩增后的长链进行有序的折叠，通过订书钉链引入检测序列，从而实现对mirnas的含量进行测定，包括如下步骤：
（1）滚环扩增：设计一对由两条单链构成的发夹结构作为识别单元，其中一条链含有与靶标mirna互补的识别序列，至少为seq.no.3的dna3、seq.no.6的dna6、seq.no.8的dna8或seq.no.10的dna10中的任一种dna；另一条为seq.no.4的dna作为引发链，取100μm识别序列与100μm引发链，以浓度比1:1在95℃温度下反应5min，缓慢降温，得到识别单元；取5μl10μm识别单元与5μl浓度在0.1nm-1μm的靶标mirna混合均匀，所述的靶标mirnas为seq.no.5的mirna5、seq.no.7的mirna7、seq.no.9的mirna9或seq.no.11的mirna11中的任一rna，37℃孵育30min，记为混合物i；取10μl混合物i，3μl4μm环dna，3μlphi29dna聚合酶，1mm脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)在rca反应缓冲液（33mmtris，10mm醋酸镁，66mm醋酸钾，0.1%体积百分比的吐温20，1mm二硫苏糖醇）混合均匀，30℃反应一定时间；反应液在65℃温度下反应10min，使dna聚合酶失活，反应产生的单链dna用乙醇沉淀，记为脚手架链被用于进行折纸反应；
（2）dna折纸：各取浓度为100um5ulseq.no.12的dna12、seq.no.13的dna13和seq.no.14的dna14富含鸟嘌呤的订书钉链混合均匀，记为混合物iii，脚手架单链dna和混合物iii以一定的摩尔比混合均匀，在含有k+的1×tae-mg2+（50mmk+，40mmtris(ph=7.4)，20mm醋酸，2mmedta，12.5mm醋酸镁）缓冲溶液中，与pcr仪中从95℃退火至4℃，速率为1℃/min，反应物记为混合物ii；
（3）检测：取10ul混合物ii，加入1μl20µm氯高铁血红素（hemin）、1μl40mmh2o2以及50μl2mmabts溶液混合均匀后，监测其在410nm处吸光值的变化。
本发明首先设计一对发夹结构的识别单元，通过与靶标mirnas结合，释放引物链，引发滚环扩增，通过控制扩增条件，得到一条长的具有重复序列的dna单链，实现靶标信号放大；利用dna折纸技术，将扩增产物有序折叠，同时引入富含鸟嘌呤（g）的序列，在有k+存在的条件下，该序列能形成g-四联体（g-quadruplex），g-四联体与氯高铁血红素（hemin）孵育后，形成的dnazyme具有很高过氧化物酶活性（简称hrpdnazyme），dnazyme具有催化还原h2o2的能力，可氧化鲁米诺化学发光，也可氧化abts生成蓝绿色的自由基阳离子（abts.+）从而实现检测信号的输出。
进一步的，取识别序列dna100μm与100μm引发链，以浓度比1:1在95℃温度下反应5min，缓慢降温，得到识别单元。
所述的rca反应缓冲液为：33mmtris，10mm醋酸镁，66mm醋酸钾，0.1%体积百分比的吐温20，1mm二硫苏糖醇。
本发明首先利用了滚环扩增对所检测核酸进行信号放大，随后利用dna折纸术对扩增后的长链进行有序的折叠，通过订书钉链引入检测序列，从而实现对mirnas的含量进行测定。
所述的mirnas可以为本领域常规的mirnas，优选的为let-7a，has-mir-21，mir-1，has-mir-144。
所用的反应缓冲溶液均采用焦碳酸二乙酯（depc）处理后的milliq水中进行配置。
所述的环dna的合成方法为本领域常规的合成方法，优选的方法参考2015年2月19日发表在angewandtechemie中第127卷第8期题目为growthandorigamifoldingofdnaonnanoparticlesforhigh-efficiencymoleculartransportincellularimaginganddrugdelivery的论文的supportingonlineinformation第1页中所记载的方法。
所述的滚环扩增的时间为本领域常规的反应时间，较佳的时间范围是5-30min，优选的反应时间为10min。
所述的脚手架链与订书钉链的混合比例为本领域常规的比例，较佳的为反应摩尔比为1:10-1:100，优选的反应摩尔比为1:20。
本发明的优点在于：
（1）本发明以滚环扩增进行信号放大，不需要高温变性过程，反应迅速，提高检测灵敏度。
（2）本发明利用dna折纸的技术对扩增产物进行折叠，使引入的检测序列可以有序的排布，避免了检测序列直接环绕造成的信号干扰。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
一种基于滚环扩增和dna折纸术检测mirnas的方法，利用滚环扩增对所检测核酸进行信号放大，随后利用dna折纸术对扩增后的长链进行有序的折叠，通过订书钉链引入检测序列，从而实现对mirnas的含量进行测定，包括如下步骤：
1、滚环扩增：
（1）合成环dna：环dna的合成方法参考2015年2月19日发表在angewandtechemie中第127卷第8期题目为growthandorigamifoldingofdnaonnanoparticlesforhigh-efficiencymoleculartransportincellularimaginganddrugdelivery的论文的supportingonlineinformation第1页中所记载的方法。100μm磷酸修饰dna1与100μm连接模板dna2混合均匀后，与90℃反应1min。待溶液降温至室温后，加入t4连接酶及t4连接酶反应缓冲液，于25℃反应16hr，随后反应液于65℃反应10min使酶失活。所得的环dna与t4聚合酶及反应混合液混合均匀后，于37℃反应16hr，以去除连接模板dna2，随后反应液于85℃反应10min使酶失活。反应混合液采用30kd超滤管于3000g超滤10min，收集管底纯净的溶液，即可得环dna。
（2）滚环扩增：2.5μl100μm识别序列dna3与2.5μl100μm引发链dna4，以浓度比1:1混合均匀后在95℃温度下反应5min，缓慢降温，得到识别单元；取5μl10μm识别单元与5μl1nm靶标mirna5混合均匀，37℃孵育30min，记为混合物i；取10μl混合物i、3μl4μm环dna，3μlphi29dna聚合酶，1mmdntp在rca反应缓冲液（33mmtris，10mm醋酸镁，66mm醋酸钾，0.1%（体积/体积）吐温20，1mm二硫苏糖醇）混合均匀，30℃反应10min。反应液在65℃温度下反应10min，使phi29dna聚合酶失活。反应产生的单链dna用乙醇沉淀，记为脚手架链被用于进行折纸反应。
2、dna折纸：
各取5ul富含鸟嘌呤的订书钉链dna12-14（100um）混合均匀，记为混合物iii，脚手架单链dna和混合物iii以1:20的摩尔比混合均匀，在含有k+的1×tae-mg2+（50mmk+，40mmtris(ph=7.4)，20mm醋酸，2mmedta，12.5mm醋酸镁）缓冲溶液中，与pcr仪中从95℃退火至4℃，速率为1℃/min，反应后记为混合物ii。
3、检测：
取10ul混合物ii，加入1μl20µmhemin、1μl40mmh2o2以及50μl2mmabts溶液混合均匀后，监测其在410nm处吸光值的变化，从而实现对mirnas的含量进行测定。
实施例2
与实施例1步骤近似，包括：
1、滚环扩增：
（1）合成环dna：环dna的合成方法参考2015年2月19日发表在angewandtechemie中第127卷第8期题目为growthandorigamifoldingofdnaonnanoparticlesforhigh-efficiencymoleculartransportincellularimaginganddrugdelivery的论文的supportingonlineinformation第1页中所记载的方法。100μm磷酸修饰dna1与100μm连接模板dna2混合均匀后，于90℃反应1min，待溶液降温至室温后，加入t4连接酶及t4连接酶反应缓冲液，于25℃反应16hr，随后反应液于65℃反应10min使酶失活。所得的环dna与t4聚合酶及反应混合液混合均匀后，于37℃反应16hr，以去除连接模板dna2，随后反应液于85℃反应10min使酶失活。反应混合液采用30kd超滤管于3000g超滤10min，收集管底纯净的溶液，即可得环dna。
（2）滚环扩增：2.5μl100μm识别序列dna6与2.5μl100μm引发链dna4，以浓度比1:1混合均匀后在95℃温度下反应5min，缓慢降温，得到识别单元。取5μl10μm识别单元与5μl1nm靶标mirna7混合均匀，37℃孵育30min，记为混合物i。取10μl混合物i、3μl4μm环dna，3μlphi29dna聚合酶，1mmdntp在rca反应缓冲液（33mmtris，10mm醋酸镁，66mm醋酸钾，0.1%（体积/体积）吐温20，1mm二硫苏糖醇）混合均匀，30℃反应10min。反应液在65℃温度下反应10min，使phi29dna聚合酶失活。反应产生的单链dna用乙醇沉淀，记为脚手架链被用于进行折纸反应。
2、dna折纸：
各取5ul富含鸟嘌呤的订书钉链dna12-14（100um）混合均匀，记为混合物iii，脚手架单链dna和混合物iii以1:20的摩尔比混合均匀，在含有k+的1×tae-mg2+（50mmk+，40mmtris(ph=7.4)，20mm醋酸，2mmedta，12.5mm醋酸镁）缓冲溶液中，与pcr仪中从95℃退火至4℃，速率为1℃/min，反应后记为混合物ii。
3、检测：
取10ul混合物ii，加入1μl20µmhemin、1μl40mmh2o2以及50μl2mmabts溶液混合均匀后，监测其在410nm处吸光值的变化。
实施例3
与实施例1步骤近似，包括：
1、滚环扩增：
（1）合成环dna：环dna的合成方法参考2015年2月19日发表在angewandtechemie中第127卷第8期题目为growthandorigamifoldingofdnaonnanoparticlesforhigh-efficiencymoleculartransportincellularimaginganddrugdelivery的论文的supportingonlineinformation第1页中所记载的方法。100μm磷酸修饰dna1与100μm连接模板dna2混合均匀后，于90℃反应1min。待溶液降温至室温后，加入t4连接酶及t4连接酶反应缓冲液，于25℃反应16hr，随后反应液于65℃反应10min使酶失活。所得的环dna与t4聚合酶及反应混合液混合均匀后，于37℃反应16hr，以去除连接模板dna2，随后反应液于85℃反应10min使酶失活。反应混合液采用30kd超滤管于3000g超滤10min，收集管底纯净的溶液，即可得环dna。
（2）滚环扩增：2.5μl100μm识别序列dna8与2.5μl100μm引发链dna4，以浓度比1:1混合均匀后在95℃温度下反应5min，缓慢降温，得到识别单元。取5μl10μm识别单元与5μl1nm靶标mirna9混合均匀，37℃孵育30min，记为混合物i。取10μl混合物i、3μl4μm环dna，3μlphi29dna聚合酶，1mmdntp在rca反应缓冲液（33mmtris，10mm醋酸镁，66mm醋酸钾，0.1%（体积/体积）吐温20，1mm二硫苏糖醇）混合均匀，30℃反应10min。反应液在65℃温度下反应10min，使phi29dna聚合酶失活。反应产生的单链dna用乙醇沉淀，记为脚手架链被用于进行折纸反应。
2、dna折纸：
各取5ul富含鸟嘌呤的订书钉链dna12-14（100um）混合均匀，记为混合物iii，脚手架单链dna和混合物iii以1:20的摩尔比混合均匀，在含有k+的1×tae-mg2+（50mmk+，40mmtris(ph=7.4)，20mm醋酸，2mmedta，12.5mm醋酸镁）缓冲溶液中，与pcr仪中从95℃退火至4℃，速率为1℃/min，反应后记为混合物ii。
3、检测：
取10ul混合物ii，加入1μl20µmhemin、1μl40mmh2o2以及50μl2mmabts溶液混合均匀后，监测其在410nm处吸光值的变化。
实施例4
与实施例1步骤近似，包括：
1、滚环扩增：
（1）合成环dna：环dna的合成方法参考2015年2月19日发表在angewandtechemie中第127卷第8期题目为growthandorigamifoldingofdnaonnanoparticlesforhigh-efficiencymoleculartransportincellularimaginganddrugdelivery的论文的supportingonlineinformation第1页中所记载的方法。100μm磷酸修饰dna1与100μm连接模板dna2混合均匀后，与90℃反应1min。待溶液降温至室温后，加入t4连接酶及t4连接酶反应缓冲液，于25℃反应16hr，随后反应液于65℃反应10min使酶失活。所得的环dna与t4聚合酶及反应混合液混合均匀后，于37℃反应16hr，以去除连接模板dna2，随后反应液于85℃反应10min使酶失活。反应混合液采用30kd超滤管于3000g超滤10min，收集管底纯净的溶液，即可得环dna。
（2）滚环扩增：2.5μl100μm识别序列dna10与2.5μl100μm引发链dna4，以浓度比1:1混合均匀后在95℃温度下反应5min，缓慢降温，得到识别单元。取5μl10μm识别单元与5μl1nm靶标mirna11混合均匀，37℃孵育30min，记为混合物i。取10μl混合物i、3μl4μm环dna，3μlphi29dna聚合酶，1mmdntp在rca反应缓冲液（33mmtris，10mm醋酸镁，66mm醋酸钾，0.1%（体积/体积）吐温20，1mm二硫苏糖醇）混合均匀，30℃反应10min。反应液在65℃温度下反应10min，使phi29dna聚合酶失活。反应产生的单链dna用乙醇沉淀，记为脚手架链被用于进行折纸反应。
2、dna折纸：
各取5ul富含鸟嘌呤的订书钉链dna12-14（100um）混合均匀，记为混合物iii，脚手架单链dna和混合物iii以1:20的摩尔比混合均匀，在含有k+的1×tae-mg2+（50mmk+，40mmtris(ph=7.4)，20mm醋酸，2mmedta，12.5mm醋酸镁）缓冲溶液中，与pcr仪中从95℃退火至4℃，速率为1℃/min，反应后记为混合物ii。
3、检测：
取10ul混合物ii，加入1μl20µmhemin、1μl40mmh2o2以及50μl2mmabts溶液混合均匀后，监测其在410nm处吸光值的变化。
<110>上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120>基于滚环扩增和dna折纸术检测mirnas的方法
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<212>dna
<213>人工序列
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