本发明属于微生物工程改造
技术领域：
，具体涉及一种耐温植酸酶生产菌株及其应用。
背景技术：
：植酸酶（phytase），即肌醇六磷酸水解酶（myo-inositolhexaphosphatephosphohydrotase），是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称（黄遵锡，1999，食品与发酵工业）。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸盐降解为无机磷和肌醇，同时释放出植酸盐结合的其他营养物质。可广泛用作饲料添加剂。目前，利用植酸酶饲喂单胃动物的效果已经得到了验证。饲料中添加植酸酶后，可以减少5-70%无机磷的用量，粪便中磷的排放量减少了30-40%以上，不仅大大降低了植酸盐的抗营养作用，增加生产效益，还能有效的降低环境污染，因此对植酸酶的研究具有重要的意义。目前天然材料中植酸酶的表达水平较低，加之天然植酸酶的某些生物学特性（如热稳定性，抗蛋白酶特性等）不能完全适合饲料加工的要求。随着生物技术的飞速发展，采用基因工程的手段，不仅可以提高植酸酶的酶活力，还能通过构建工程菌株改造酶的热稳定性，使之更加适应工业化生产的条件。技术实现要素：本发明为解决现有技术问题，提供了一株生产耐温植酸酶的里氏木霉菌株及其应用。申请人首先构建得到重组表达耐高温植酸酶突变体的里氏木霉重组菌株，然后通过对该重组菌株进行分子改造，进一步提高了其所产植酸酶的耐热性，有利于植酸酶在饲料领域中的广泛应用。为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌，其携带有表达植酸酶基因的重组载体。所述的植酸酶，其氨基酸序列为seqidno:1，其编码基因的序列为seqidno:2。本发明一方面提供了一种突变菌株里氏木霉om-g3phy（trichodermareeseiom-g3phy），已于2018年11月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为cctccno:m2018836。本发明还提供了所述里氏木霉突变株在生产植酸酶中的应用。本发明所述突变菌株里氏木霉om-g3phy摇瓶发酵上清液中植酸酶酶活达1950u/ml，比出发菌提高了54.5%；20l罐发酵上清液中植酸酶酶活高达16680u/ml，比出发菌株提高了49.8％。而且，75℃、80℃和85℃处理3min后，突变菌株里氏木霉om-g3phy发酵上清液中植酸酶的残留酶活分别为86.85%，80.06%，45.44%，显著高于里氏木霉o11-g3phy所产植酸酶，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株发酵产植酸酶酶活水平高，耐热性强，可广泛应用于饲料生产领域。具体实施方式本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecularcloning:alaboratorymanual,3nded.(sambrook,2001)和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。下面结合具体的实施方式对本发明进行详细描述。实施例1耐高温植酸酶重组表达菌株的构建申请人利用蛋白质工程技术改造获得一个耐高温突变体植酸酶g3phy，其氨基酸序列为sedidno：1。申请人根据木霉的密码子偏好性，将植酸酶g3基因进行了密码子优化，由通用生物系统（安徽）有限公司合成植酸酶g3的编码核苷酸序列sedidno：2。以合成的核苷酸序列为模板，利用引物g3phy-f和g3phy-r扩增出g3phy基因片段。pcr引物序列如下：g3phy-f：ggctctagacagtcggagcccgagctgaagc；g3phy-r：ataacgcgtttagagcgagcaggcggggatt；反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，g3phy基因为大小1233bp的片段。将上述获得的g3phy基因片段与表达载体pc2g分别用限制性内切酶xbai和mlui进行双酶切，并胶回收目的片段，将胶回收得到的g3phy基因双酶切片段和表达载体pc2g双酶切片段用t4dna连接酶连接过夜，转化大肠杆菌dh5a感受态，涂布于lb+amp平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落pcr验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到重组表达质粒pc2g-g3phy。原生质体制备：取宿主菌里氏木霉（trichodermareesei）o11菌株孢子悬液，接种于pda+u(马铃薯200g/l，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；uridine1％；琼脂粉1.5％)平板上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120mlyeg+u（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、0.1%尿苷）的液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养14~16h；用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20ml10mg/ml裂解酶液（sigmal1412）的三角瓶中，30℃，90rpm作用1-2h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；将预冷的20ml1.2m山梨醇（1.2m山梨醇，50mmtris-cl，50mmcacl2）加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入预冷的5ml1.2m山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入适量预冷的1.2m山梨醇悬浮分装（200μl/管，原生质体浓度为108个/ml）。表达载体转化：以下操作均在冰上进行，取10μg重组质粒pc2g-g3phy加入到含有200μl原生质体溶液的7ml无菌离心管中，然后加入50μl25%peg（25%peg，50mmtris-cl，50mmcacl2），轻弹管底混匀，冰上放置20min；加入2ml25%peg，混匀后室温放置5min；加入4ml1.2m山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55℃的上层培养基中（0.1%mgso4,1%kh2po4,0.6%(nh4)2so4,1%葡萄糖,18.3%山梨醇,0.35%琼脂糖）；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上（2%葡萄糖，0.5%(nh4)2so4，1.5%kh2po4，0.06%mgso4，0.06%cacl2，1.5%琼脂），30℃培养5~7d至有转化子长出，将生长出的转化子挑至下层培养基平板复筛，菌落边缘形态较光滑的菌株为即为阳性转化子。发酵验证和酶活测定：将上述复筛得到的阳性转化子分别接种至pda(马铃薯200g/l，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；琼脂粉1.5％)固体平板，在30℃恒温培养箱倒置培养6-7天，待孢子丰富后，分别取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50ml发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(nh4)2so4，0.09%mgso4，2%kh2po4，0.04%cacl2，0.018%吐温-80，0.018%微量元素）的250ml三角瓶中，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时，取发酵上清液进行植酸酶酶活力测试。（1）酶活测定方法酶活定义：在温度37℃、ph5.5条件下，每分钟从浓度5.0mmol/l植酸钠溶液中释放1μmol/l无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以u表示。测定方法：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾（5.9）于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液（5.1）溶解，并定容至100ml，浓度为50.0mmol/l。按表1的比例用乙酸缓冲液（5.2）稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y=ax+b）。反应后的试样在水浴中静置10min，在离心机（6.7）上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计（6.3）415nm波长处测定样品空白（a0）和样品溶液（a）的吸光值，a-a0为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。植酸酶活性按下式计算：u=f×c/(m×30)式中：u--试样中植酸酶的活性，u/g；c--根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，u；f--试样溶液反应前的总稀释倍数；m--试样质量，g；30--反应时间，min。结果显示，本发明构建得到的里氏木霉工程菌摇瓶发酵上清液的植酸酶酶活最高能达到1110u/ml。申请人将酶活最高的这株里氏木霉工程菌命名为里氏木霉o11-g3phy（trichodermareeseio11-g3phy）。实施例2里氏木霉o11-g3phy尿嘧啶营养缺陷型筛选原理：5-氟乳清酸可以诱导菌体缺失尿嘧啶核苷酸合成途径中的乳清核苷酸转移酶或乳清苷单磷酸脱羧酶，从而使5-氟乳清酸无法形成有毒的物质5-氟尿嘧啶核苷酸，从而产生了对5-氟乳清酸的抗性，其嘧啶核苷酸营养可以通过向培养基中添加尿嘧啶进行补充，因此利用5-氟乳清酸诱导形成的尿嘧啶营养缺陷型菌株可以在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培养基中生长；而野生型菌株因不具备对5-氟乳清酸的抗性，无法在含有5-氟乳清酸的培养条件下生长。因此常用5-氟乳清酸来筛选尿嘧啶缺陷型的突变株。筛选方法：将实施例1筛选到的里氏木霉o11-g3phy工程菌的孢子以0.1%的吐温-20溶液稀释至约1×107个/ml，然后将孢子悬液均匀涂布于含有1.5g/ml5-氟乳清酸和1.87g/ml尿嘧啶核苷（uridine）的基本固体培养基(2％葡萄糖，0.5％(nh4)2so4，1.5％kh2po4，0.06％mgso4，0.06％cacl2，1.5％琼脂)平板上，避光30℃培养7d以上。结果显示，平板上都有一定数量的菌落长出，说明这些菌落有可能是里氏木霉o11-g3phy工程菌的尿嘧啶缺陷型菌株。分别挑取平板上长出的菌落，将每个菌落分别涂布于基本培养基平板和含有1.87g/mluridine的基本培养基平板进行验证。真正的尿嘧啶缺陷型菌株只能在含有uridine的基本培养基平板上生长，而在缺少uridine的基本培养基平板上无法生长。最终，申请人筛选到1株生长状态相对最好的尿嘧啶缺陷型菌株，命名为里氏木霉o11-g3phy-p（trichodermareeseio11-g3phy-p）。实施例3endot基因的敲除endot基因敲除质粒的构建：以里氏木霉（trichodermareesei）基因组为模板，利用引物endotu-f、endotu-r扩增endot基因上游序列，利用引物endotd-f、endotd-r扩增endot基因下游序列。endot基因的编码核苷酸序列为seqidno:3。pcr引物序列如下：引物endotu-f：tggtcaagtcggtaaagctgt；引物endotu-r：ccctataagctcgccaaggaa；引物endotd-f：gtgcatgctggtcccgcctgg；引物endotd-r：cacagtaaccaaaaccaataa；反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列endotu大小为1320bp，下游序列endotd大小为1396bp。将上述获得的上下游序列endotu、endotd片段分别通过kpni、sphi与敲除载体pmd18t-pyrg连接，构建敲除质粒pqc-endot，其中上下游序列endotu、endotd分别位于筛选标记pyrg两侧。取实施例2获得的里氏木霉o11-g3phy-p菌株孢子悬液，按照实施例1所述方法，制备原生质体，并将重组质粒pqc-endot转化入原生质体中，筛选获得endot基因被敲除的转化子，将其命名为里氏木霉oe-g3phy（trichodermareeseioe-g3phy）。按照实施例1所述方法进行发酵验证和酶活测定，结果显示里氏木霉oe-g3phy菌株发酵上清液的植酸酶酶活约为1262u/ml。实施例4植酸酶的耐热性测试将实施例1所述重组表达植酸酶g3的里氏木霉o11-g3phy菌株和实施例3所述敲除endot基因的里氏木霉oe-g3phy菌株的发酵上清液，分别在恒温75℃、80℃和85℃处理3min后，冰水混合物速冷后测定植酸酶的残留酶活。以热处理前的初始酶活计100%，计算酶活残留率，结果见表1。酶活残留率（%）=（初始酶活-热处理后的酶活）/初始酶活×100%表1热处理后里氏木霉发酵上清液中植酸酶酶活残留率里氏木霉75℃处理3min80℃处理3min85℃处理3mino11-g3phy62.43%55.28%19.07%oe-g3phy86.65%79.86%45.37%本发明通过将里氏木霉o11-g3phy中的endot基因进行敲除，获得里氏木霉oe-g3phy，两者均能高效重组表达植酸酶g3phy。从表1的数据可以看出，与里氏木霉o11-g3phy相比，里氏木霉oe-g3phy重组表达的植酸酶耐热性得到明显提高,85℃处理3min后仍能保留45.37%的酶活，而里氏木霉o11-g3phy重组表达的植酸酶残留酶活仅有19.07%，取得了意料不到的技术效果。实施例5紫外诱变及筛选紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。申请人以里氏木霉oe-g3phy为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其植酸酶的产量。1、确定致死率：将里氏木霉oe-g3phy接种于pda平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×107)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布pda平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。2、第一轮诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×107)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布pda平板，30℃培养2-3d。共涂布200块pda平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出40-60个菌落，先通过菌落形态，筛选出短分枝的突变体。申请人挑取出菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共110个，分别到pda平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行植酸酶活力检测，同时以出发菌株里氏木霉工程菌oe-g3phy作为对照组。结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的110株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中植酸酶的酶活高于出发菌；其中，85株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余25株突变菌的酶活甚至比出发菌普遍降低了5-10%。申请人按照上述方法继续进行了8轮诱变筛选，最终获得1株植酸酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为里氏木霉om-g3phy。里氏木霉om-g3phy摇瓶发酵上清液中植酸酶的酶活最高，达1950u/ml，比出发菌提高了54.5%。进一步地，申请人将出发菌株里氏木霉oe-g3phy和上述突变菌株里氏木霉om-g3phy分别在20l罐中进行发酵。发酵160h后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行植酸酶活力检测。结果显示，出发菌株里氏木霉oe-g3phy发酵上清液中植酸酶酶活为11135u/ml，而突变菌株里氏木霉om-g3phy的发酵上清液中植酸酶酶活高达16680u/ml，比出发菌株提高了49.8％，取得了意料不到的技术效果。申请人参照实施例4所述方法进一步对突变菌株om-g3phy重组表达的植酸酶的耐热性进行测试，同时以出发菌oe-g3phy作为对照。结果显示，75℃、80℃和85℃处理3min后，突变菌株里氏木霉om-g3phy发酵上清液中植酸酶的残留酶活分别为86.85%，80.06%，45.44%，与出发菌基本相当。综上，本发明首先构建得到重组表达耐高温植酸酶g3phy的里氏木霉重组菌株o11-g3phy；然后对该重组菌株进行分子改造，敲除endot基因，获得里氏木霉oe-g3phy，其所产植酸酶的耐热性得到显著提高。为了提高植酸酶的产量，申请人以里氏木霉oe-g3phy为出发菌，通过紫外诱变的方式筛选获得一株高产耐温植酸酶的突变菌里氏木霉om-g3phy，其发酵上清液中植酸酶的酶活水平得到显著提高，且突变并未影响其所产植酸酶的耐热性，取得了意料不到的技术效果。申请人已于2018年11月28日将里氏木霉om-g3phy（trichodermareeseiom-g3phy）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018836。序列表<110>青岛蔚蓝生物集团有限公司潍坊康地恩生物科技有限公司<120>一种耐温植酸酶生产菌株及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>410<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1glnsergluprogluleulysleugluservalvalilevalserarg151015hisglyvalargalaprothrlysphethrglnleumetglnaspval202530thrproaspalatrpprothrtrpprovallysleuglygluleuthr354045proargglyglygluleuilealatyrleuglyhistyrtrparggln505560argleuvalalaaspgluleuleuprolyscysglycysproglnpro65707580glyglnvalalaileilealaaspvalaspgluargthrarglysthr859095glyglualaphealaalaglyleualaproaspcysalailethrval100105110hishisglnalaaspthrserserproaspproleupheaspproleu115120125lysthrglyvalcysglnleuaspvalalaasnvalthrargalaile130135140leugluargalaglyglyserilealaaspphethrglyhistyrgln145150155160proalaphearggluleugluargvalleuasnpheproglnserpro165170175leucysleulysargglulysglnaspgluprocysserleuthrgln180185190alaleuprosergluleulysvalseralaaspasnvalserleuthr195200205glyalatrpserleualasermetleuthrgluilepheleuleugln210215220glnalaglnglymetprogluproglytrpglyargilethraspser225230235240hisglntrpasnthrleuleuserleuhisasnalaglnpheaspleu245250255leuglnargthrprogluvalalaargserargalathrproleuleu260265270aspleuilelysthralaleuthrprohisproproglnlysglnala275280285tyrglyvalthrleuprothrservalleupheilealaglyhisasp290295300thrasnleualaasnleuglyglyalaleugluleuasntrpthrleu305310315320proglyglnproaspasnthrproproglyglygluleuvalpheglu325330335argtrpargargleuseraspasnserglntrpileglnvalserleu340345350valpheglnthrleuglnglnmetargasplysthrproleuserleu355360365asnthrproproglygluvallysleuthrleuproglycysgluglu370375380argasnalaglnglymetcysserleualaglyserthrglnileval385390395400asnglualaargileproalacysserleu405410<210>2<211>1233<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cagtcggagcccgagctgaagctggagtcggtcgtcatcgtcagccgacacggcgtccgc60gcccccaccaagttcacgcagctcatgcaggacgtcacgcccgacgcctggcccacctgg120cccgtcaagctgggcgaactgacgccccgcggcggcgagcttatcgcctacctgggccac180tactggcgacagcgactggtcgccgacgaactcctccccaagtgcggctgcccccagccc240ggccaggtcgccatcatcgccgacgtagatgagcgaacgcgcaagacgggcgaggccttc300gccgccggcctggcccccgactgcgccatcacggtccaccaccaggccgacaccagcagc360cccgaccccctcttcgaccccttaaaaacgggcgtctgccagctggacgtcgccaacgtc420acgcgagccatcctcgaacgcgccggcggcagcatcgccgacttcacgggccactaccag480cccgccttccgagagctggagcgcgtcctcaacttcccccagtcccccctgtgcctcaag540cgagagaagcaggacgagccctgctcgctgacgcaggccctcccctcggaactaaaggtc600tccgccgacaacgtcagcctgacgggcgcctggtccctggcctcgatgctgacggaaata660ttcctcctccagcaggcccaggggatgcccgagcccggctggggccgaatcacggactcg720caccagtggaacaccctcctctcgctgcacaacgcccagttcgacctgctccaacgaacg780cccgaggtcgcccgatcgcgcgccacgcccctcctcgacctgatcaagaccgccctgacc840ccccaccccccccagaagcaggcctacggcgtcacgctccccacctcggtcctgttcatc900gccggccacgacaccaacctggccaacctgggcggcgccctggagctgaactggaccctg960cccggccagcccgacaacacgccccccggcggcg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