本发明属于生物技术领域，具体涉及一种成纤维前体细胞培养及其鉴定方法。
背景技术：
随着我国经济的发展，人们的生活质量得到提高，美容整形技术也迅猛发展，各种组织工程生物材料不断应用于面部美容与创伤治疗的修复，当前美容医学的发展也趋于简单、微创和安全的方向发展，而面部老化的治疗也是从过去的搜书治疗向生物医学制剂注射治疗开始转化，当前主要的生物注射制剂有胶原蛋白、透明质酸酶、胚胎干细胞和肉毒素等，除肉毒素是作用于面部动态皱纹外，其他的均适用于治疗皮肤老化所致的细小皱纹。胶原蛋白和透明质酸酶是真皮组织细胞外界质的主要成分，在皮肤中主要起生物替代作用，使老化皮肤逐渐减少的真皮厚度与细胞外基质得到补充，具有除皱效果明显、起效快的特点；但这些成分多数是异体或异种成分，存在免疫排斥的过敏反应的可能，且生物代谢作用使之很快降解，效果持续时间短暂是这类产品的主要缺陷。
近年来欧美研究学者应用自体成纤维细胞进行治疗，其过程简述为从治疗者的皮肤中分离出成纤维前体细胞(taf)，体外扩散后，注射到治疗者的凹陷或皱纹部位，达到修复皮肤缺损的治疗效果。但是目前尚未有对taf在改善皮肤缺损和除皱整形方面有效的培养和鉴定方法。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种成纤维前体细胞培养及其鉴定方法，按照先后顺序包括以下步骤：
(1)：taf的培养：取人大腿皮肤样品切块后用pbs中冲洗，再加入dmem培养液，于培养箱中传代培养，以mtt法测定taf的生长曲线，实验选取p5-p10代的细胞；
(2)：rna提取和pt-pcr：提取上述细胞的rna，取高纯度rna进行pcr检测，pcr产物再经凝胶电泳分析；
(3)：流式细胞仪检测：取p5代taf细胞冲洗过滤，调整细胞浓度，每管分别加入pe标记的cd90、cd105、同型对照但荧光标记抗体，低温处理后，进行流式细胞仪检测；
(4)：免疫荧光检测：将taf细胞与brdu共同培养，传代扩增培养，应用抗brdu的抗体进行检测，将人大腿皮皮肤组织块固定，包埋，切片后，用抗i型胶原的单克隆抗体4℃孵育过夜，再用titc标记的山羊二抗染色并观察；
(5)：诱导分化：取taf细胞，接种到细胞培养皿中贴壁培养，更换为诱导培养液诱导培养，再更换为维持培养液维持，然后更换为诱导培养液，依次循环，采用油红o染色，再观察；
(6)：克隆成型：配制琼脂溶液，灭菌，至于细胞培养箱中静置晒干，取taf细胞加入dmem培养基和琼脂溶液中培养，再观察并统计克隆数。
优选的是，步骤(1)中，所述dmem培养液包括dmem、10％fbs、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素，培养条件为37℃、5％co2培养箱中培养。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，pcr检测的特异性的基因包括：hla-i，hla-dr，rt-pcr。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，pcr检测反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s,72℃延伸10min。
在上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，所述诱导培养液包括dmem、10％fbs、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、1μmol/l地塞米松、1.7μmol/l胰岛素、0.2mmol/l吲哚美辛、0.5mmol/libmx。
在上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，所述维持培养液包括dmem、10％fbs、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、1.7μmol/l胰岛素。
本发明对分离得到的taf细胞做了初步鉴定，并且对裸鼠注射和组织学检查结果显示，本发明得到的大腿皮肤成纤维前体细胞能够产生i型胶原蛋白，促进真皮层的厚度，回复皮肤弹性，并且达到了一次取材、持续扩增的目的，减少了患者的痛苦，具有创伤小，疗效自然、持久等优点。
具体实施方式
为了更进一步了解本发明的发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。
一、主要材料：dmem培养基美国hyclone公司，pbs、trizol和琼脂糖美国invitrogen公司，fbs德国paa公司，胰蛋白酶、青霉素、链霉素香港gene公司，反转录试剂盒、taq酶中国vigorous公司；抗i型胶原蛋白单克隆抗体、绿色荧光标记二抗fitc美国kako公司，brdu和抗brdu抗体、pe标记的cd90、cd105、同型对照抗体美国bdbiosciences公司，油红o、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛美国sigma公司。
二、实施例一
1.taf的培养
取少量人大腿皮肤样品切块至于含有双抗的pbs中冲洗3次，用无菌镊子和剪刀将组织剪碎均匀放置于培养皿中，每块组织块上加0.2ml的dmem培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素)，于37℃、5％co2培养箱中培养，每隔2天换液，当细胞布满培养皿的85％-95％时进行传代培养，以mtt法测定taf的生长曲线，实验选取p5-p10代的细胞。
2.taf特异性标记基因的检测
取正常贴壁生长的细胞，使用trizol试剂说明书提取中rna，并对所得rna进行测定，选取纯度高的进行后续实验，取5μgrna于含200um-mulv反转录酶的20μl反应体系中反转录，20μl反转录产物直接用于pcr检测，检测间质干细胞特异性的基因包括：hla-i，hla-dr，rt-pcr反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s,72℃延伸10min，pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
取p5代taf细胞，消化收集细胞，用pbs清洗3次，200目滤纱过滤，调整细胞浓度为1×106个/ml，每管分别加入pe标记的cd90、cd105、同型对照但荧光标记抗体，4℃处理30分钟，然后进行流式细胞仪检测。
将培养的taf细胞与brdu共同培养，传代扩增培养3次后，应用抗brdu的抗体进行检测，将皮肤组织块固定，包埋，切片后，用抗i型胶原的单克隆抗体4℃孵育过夜，再用titc标记的山羊二抗染色并观察。
取生长状态良好的taf细胞，按1.0×105/cm2接种到细胞培养皿中贴壁培养，待细胞达到75％-80％融合时，更换为诱导培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素+1μmol/l地塞米松+1.7μmol/l胰岛素+0.2mmol/l吲哚美辛+0.5mmol/libmx)诱导培养3d，再更换为维持培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素+1.7μmol/l胰岛素)维持3d，然后更换为诱导培养液，依次循环20d后，采用油红o染色，再观察。
配制浓度为1.4％和0.8％的琼脂溶液，高压灭菌，放置于40℃水浴锅中，按照1:1去适量平衡好的2×dmem和1.4％的琼脂溶液培养基混匀；取上述液体3ml，冷却凝固，至于细胞培养箱中静置晒干，取生长状态良好的细胞计数，稀释成5×105个/ml，取出300μl细胞液，加到12ml按1:1混好的2×dmem培养基和0.8％的琼脂溶液中，将该细胞悬液3ml加到普邮下层胶的60皿中，每组3个重复，待上层琼脂完全凝固后，再加入3ml1×dmem细胞培养基，置于37℃二氧化碳细胞培养箱中，每3天补加细胞培养基，3周后观察并统计克隆数。
实施例二
3.taf的培养
取少量人大腿皮肤样品切块至于含有双抗的pbs中冲洗3次，用无菌镊子和剪刀将组织剪碎均匀放置于培养皿中，每块组织块上加0.2ml的dmem培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素)，于37℃、5％co2培养箱中培养，每隔2天换液，当细胞布满培养皿的85％-95％时进行传代培养，以mtt法测定taf的生长曲线，实验选取p5-p10代的细胞。。
4.taf特异性标记基因的检测
取正常贴壁生长的细胞，使用trizol试剂说明书提取中rna，并对所得rna进行测定，选取纯度高的进行后续实验，取5μgrna于含200um-mulv反转录酶的20μl反应体系中反转录，20μl反转录产物直接用于pcr检测，检测间质干细胞特异性的基因包括：hla-i，hla-dr，rt-pcr反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s,72℃延伸10min，pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
取p5代taf细胞，消化收集细胞，用pbs清洗3次，200目滤纱过滤，调整细胞浓度为2×106个/ml，每管分别加入pe标记的cd90、cd105、同型对照但荧光标记抗体，4℃处理30分钟，然后进行流式细胞仪检测。
将培养的taf细胞与brdu共同培养，传代扩增培养2次后，应用抗brdu的抗体进行检测，将皮肤组织块固定，包埋，切片后，用抗i型胶原的单克隆抗体4℃孵育过夜，再用titc标记的山羊二抗染色并观察。
取生长状态良好的taf细胞，按1.5×105/cm2接种到细胞培养皿中贴壁培养，待细胞达到75％-80％融合时，更换为诱导培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素+1μmol/l地塞米松+1.7μmol/l胰岛素+0.2mmol/l吲哚美辛+0.5mmol/libmx)诱导培养2d，再更换为维持培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素+1.7μmol/l胰岛素)维持3d，然后更换为诱导培养液，依次循环25d后，采用油红o染色，再观察。
配制浓度为1.4％和0.8％的琼脂溶液，高压灭菌，放置于40℃水浴锅中，按照1:1去适量平衡好的2×dmem和1.4％的琼脂溶液培养基混匀；取上述液体3ml，冷却凝固，至于细胞培养箱中静置晒干，取生长状态良好的细胞计数，稀释成5×105个/ml，取出300μl细胞液，加到12ml按1:1混好的2×dmem培养基和0.8％的琼脂溶液中，将该细胞悬液3ml加到普邮下层胶的60皿中，每组3个重复，待上层琼脂完全凝固后，再加入3ml1×dmem细胞培养基，置于37℃二氧化碳细胞培养箱中，每3天补加细胞培养基，3周后观察并统计克隆数。
实施例三
5.taf的培养
取少量人大腿皮肤样品切块至于含有双抗的pbs中冲洗3次，用无菌镊子和剪刀将组织剪碎均匀放置于培养皿中，每块组织块上加0.2ml的dmem培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素)，于37℃、5％co2培养箱中培养，每隔2天换液，当细胞布满培养皿的85％-95％时进行传代培养，以mtt法测定taf的生长曲线，实验选取p5-p10代的细胞。。
6.taf特异性标记基因的检测
取正常贴壁生长的细胞，使用trizol试剂说明书提取中rna，并对所得rna进行测定，选取纯度高的进行后续实验，取5μgrna于含200um-mulv反转录酶的20μl反应体系中反转录，20μl反转录产物直接用于pcr检测，检测间质干细胞特异性的基因包括：hla-i，hla-dr，rt-pcr反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s,72℃延伸10min，pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
取p5代taf细胞，消化收集细胞，用pbs清洗3次，200目滤纱过滤，调整细胞浓度为1×106个/ml，每管分别加入pe标记的cd90、cd105、同型对照但荧光标记抗体，4℃处理30分钟，然后进行流式细胞仪检测。
将培养的taf细胞与brdu共同培养，传代扩增培养3次后，应用抗brdu的抗体进行检测，将皮肤组织块固定，包埋，切片后，用抗i型胶原的单克隆抗体4℃孵育过夜，再用titc标记的山羊二抗染色并观察。
取生长状态良好的taf细胞，按2.0×105/cm2接种到细胞培养皿中贴壁培养，待细胞达到75％-80％融合时，更换为诱导培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素+1μmol/l地塞米松+1.7μmol/l胰岛素+0.2mmol/l吲哚美辛+0.5mmol/libmx)诱导培养3d，再更换为维持培养液(dmem+10％fbs+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素+1.7μmol/l胰岛素)维持3d，然后更换为诱导培养液，依次循环30d后，采用油红o染色，再观察。
配制浓度为1.4％和0.8％的琼脂溶液，高压灭菌，放置于40℃水浴锅中，按照1:1去适量平衡好的2×dmem和1.4％的琼脂溶液培养基混匀；取上述液体3ml，冷却凝固，至于细胞培养箱中静置晒干，取生长状态良好的细胞计数，稀释成5×105个/ml，取出350μl细胞液，加到15ml按1:1混好的2×dmem培养基和0.8％的琼脂溶液中，将该细胞悬液3ml加到普邮下层胶的60皿中，每组3个重复，待上层琼脂完全凝固后，再加入3ml1×dmem细胞培养基，置于37℃二氧化碳细胞培养箱中，每3天补加细胞培养基，3周后观察并统计克隆数。
三、结果
传代培养后taf细胞生产迅速，生长曲线呈s型，接种后低1-2天为潜伏适应期，从第3天起细胞开始增值并进入对数生长期，第5、6天达到高峰，细胞在多次传代后仍具有较强的增值能力。rt-pcr的检测结果显示该细胞能够表达间充质干细胞部分标记基因hla-i和hla-dr。流式细胞仪检测结果表明分离得到的taf细胞表达部分间充质干细胞特异性标记基因cd90(97.62％)、cd105(26.33％)，证明分离的taf细胞具有一定的间充质干细胞特性。分离的taf经过brdu抗体检测，结果显示有9％-12％为brdu阳性，说明组织块分离的taf在一定程度上具有干细胞特性。分离的taf细胞在体外诱导11d后，细胞核周围出现小脂肪滴，并且随着诱导时间的延长，小脂肪滴渐渐变大，对脂肪滴进行油红o染色，明显呈红色。将培养的taf制成细胞琼脂悬液，培养15天，无细胞克隆出现。
四、小鼠注射实验
将30只balb/c小鼠水机分为3组，一组为空白组；二组注射无taf细胞液的注射液；三组注射细胞。
注射后的小鼠健康状况良好，皮肤改变不明显，无任何验证和肿块现象，皮肤刺激无差异。将三组小鼠局部皮肤检测后发现各组上皮和真皮细胞结构正常，无任何验证，但是注射taf细胞的一组小鼠的真皮增厚，通过显微镜观察，注射部位皮肤产生i型胶原蛋白。
本领域技术人员不难理解，本发明的成纤维前体细胞培养及其鉴定方法方法包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。