水稻OsMYB6基因及其编码蛋白在抗旱和抗盐中的应用的制作方法

本发明属于植物生物技术领域，它涉及一种能够提高植物响应干旱和盐胁迫抗性基因及其应用，具体涉及一种水稻osmyb6基因及其编码蛋白在抗旱和抗盐中的应用。

背景技术：

盐渍土分布于全球各地，范围极广，覆盖面积约1×10⁹hm²，其中干旱、半干旱地区，约一半的灌溉用地受盐渍化影响，同时非灌溉地区土地盐渍化也十分严重，中国土地盐渍化大约占到全球盐渍化面积的1/10，且土地盐渍化逐渐呈现上升的趋势，据统计次生盐渍地超过6×10⁶hm²，占全国耕地面积的25%。中国盐渍土地分布广、面积大、类型多，其中华北平原、东北平原、西北平原和滨海地区分布相对集中。近年来，由于人们不合理的耕作及工业发展的进一步加深，导致土壤中的盐分含量大大增加，使土壤次生盐渍化加重。因此，中国土壤盐渍化和干旱程度越来越严重，已经成为限制植物栽培的重要因素之一。研究植物的干旱和盐胁迫调控机制，选育抗盐和抗干旱植物，有利于农业的生产、增产，有助于干旱和盐碱地的治理、改良。水稻是我国主要粮食作物之一，在我国农业生产上举足轻重。与大麦、小麦、玉米等农作物相比，水稻更容易遭受干旱和盐胁迫的危害。所以，进行干旱和盐胁迫响应水稻基因挖掘并进行其分子机理研究尤为必要，且亟需进行。在传统育种基础上，借助分子育种手段，培育抗旱、抗高盐的水稻新品种，从而推动水稻在干旱和盐碱地的大面积推广种植，加快水稻产业链的发展。

非生物胁迫严重影响植物的生长、发育和作物的产量。为了抵抗这些极端环境，植物已经演化出了错综复杂的调控网络以抵抗这些极端环境对植物的危害。在这些调控网络中，转录因子通过直接抑制或者激活下游基因的表达，在植物抵抗非生物胁迫抗性中起重要的作用。目前，许多转录因子，例如myb家族转录因子，已经被证实在植物响应非生物胁迫反应中起重要的调控作用。另外，植物在遭遇干旱或者盐胁迫的时候，植物体内一些生理指标（例如脯氨酸、丙二醛等；其中脯氨酸可以保护植物免遭干旱和盐胁迫危害；丙二醛可以用来衡量非生物胁迫对植物细胞膜破坏程度）和一些酶的活性（例如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等，这两种酶可以保护植物免遭非生物胁迫危害）会迅速改变使得植物能够在这些极端环境条件下更好的生存。

myb蛋白是植物最重要的转录因子之一，在其n末端含有一个高度保守的myb结构域。基于保守域重复氨基酸的数目和氨基酸序列的特征，myb家族被分成4个亚家族:r2r3-myb,myb1-r,4r–myb和r1r2r3-myb。越来越多的研究表明，myb蛋白参与植物对非生物胁迫响应的调控。总之，尽管许多myb蛋白已经被克隆和功能分析，但是水稻myb家族响应干旱和盐胁迫的基因仍然罕见报道。因此，克隆水稻myb家族参与干旱和盐胁迫调控基因并对其功能进行研究，为抗旱和抗盐水稻品种培育提供一个新的基因资源，为培育抗盐和抗干旱植物提供分子理论基础，有助于我国干旱和盐碱地得到有效的开发利用，进而促进我国国民经济的可持续发展和生态环境的有效保护。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种水稻osmyb6基因及其编码蛋白在抗旱和抗盐中的应用，该基因可以提高植物的抗干旱和抗盐能力，对植物应对逆境胁迫的分子育种具有重要价值，它可以用于水稻、小麦等禾谷类作物抗旱和抗盐品种的分子培育。

本发明的目的是以下述方式实现的：

水稻osmyb6基因，其核苷酸序列为seqidno.1，其基因开放阅读框的核苷酸序列为seqidno.2，其cdna编码的氨基酸序列为seqidno.3。

一种重组构建体，包括上述基因的核苷酸序列，所述构建体用的载体为用于克隆的pmd18-t载体或者用于表达的pcambia1301载体。

如上述的基因的核苷酸序列的转基因农杆菌为eha105。

如上述的基因的核苷酸序列在植物组织表达中的应用。

所述植物组织为根、茎、叶、花或种子。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物为水稻、小麦、大麦、高粱或玉米，所述双子叶植物为拟南芥、番茄、烟草、大豆或土豆。

一种功能类似蛋白，它的氨基酸序列与seqidno.3所示的氨基酸序列具有不小于30%的同源性，该蛋白在培育耐旱耐盐品种植物中的应用。

相对于现有技术，本发明的优点在于：

首先对osmyb6基因进行了组织特异性表达分析，qrt-pcr结果表明osmyb6基因在水稻叶片处高效表达；然后将osmyb6基因构建到以35s启动子启动的植物表达载体pcambia1301中，获得重组载体pcambia1301-osmyb6，将重组载体转入农杆菌用于进一步的转化。以水稻愈伤为受体，利用农杆菌介导法将构建好的载体转入到水稻愈伤组织中，获得omyb6转基因纯合体株系；然后对osmyb6转基因株系进行表型和干旱、盐胁迫分析。表型分析显示，超表达osmyb6基因不影响植物的生长和发育。干旱和盐胁迫实验分析显示，超表达osmyb6基因增加了转基因水稻对干旱和盐胁迫抗性。此外，我们已经种植了4代转基因株系，并且从t1代开始osmyb6转基因水稻就可以显著提高干旱和盐胁迫抗性，说明我们获得的osmyb6转基因植株是可以稳定遗传的。osmyb6基因是水稻干旱和盐胁迫的关键调控基因，表明可以利用基因工程技术提高水稻抵抗干旱和盐胁迫抗性，在利用生物工程技术有目的调控植物耐干旱和盐胁迫特性，通过分子育种手段培育耐干旱和盐水稻新品种进而促进水稻在干旱和盐碱地大面积推广种植方面具有非常重要的应用价值。该基因可以用于水稻、小麦等禾谷类作物耐干旱和耐盐品种的培育。

附图说明

图1表示osmyb6在水稻不同组织中的表达量；

图2表示osmyb6在干旱胁迫条件下在野生型水稻中的表达量；

图3表示osmyb6在盐胁迫条件下在野生型水稻中的表达量；

图4表示osmyb6基因在转基因水稻中的表达量；

图5表示超表达osmyb6基因在水稻中的表型观察；

图6表示超表达osmyb6基因在水稻干旱胁迫条件下的表型观察；

图7表示超表达osmyb6基因在水稻干旱胁迫条件下的存活率统计结果；

图8表示超表达osmyb6基因在水稻干旱胁迫条件下的相对电导率测定结果；

图9表示超表达osmyb6基因在水稻干旱胁迫条件下的脯氨酸含量测定结果；

图10表示超表达osmyb6基因在水稻干旱胁迫条件下的丙二醛（mda）测定结果；

图11表示超表达osmyb6基因在水稻干旱胁迫条件下的过氧化氢酶（cat）测定结果；

图12表示超表达osmyb6基因在水稻干旱胁迫条件下的超氧化物歧化酶（sod）测定结果；

图13表示非生物胁迫响应基因在干旱胁迫条件下在野生型和超表达osmyb6基因水稻植株中的表达量；

图14表示超表达osmyb6基因在水稻盐胁迫条件下的表型观察；

图15表示超表达osmyb6基因在水稻盐胁迫条件下的存活率统计结果；

图16表示超表达osmyb6基因在水稻盐胁迫条件下的相对电导率测定结果；

图17表示超表达osmyb6基因在水稻盐胁迫条件下的脯氨酸含量测定结果；

图18表示超表达osmyb6基因在水稻盐胁迫条件下的丙二醛（mda）测定结果；

图19表示超表达osmyb6基因在水稻盐胁迫条件下的过氧化氢酶（cat）测定结果；

图20表示超表达osmyb6基因在水稻盐胁迫条件下的超氧化物歧化酶（sod）测定结果；

图21表示非生物胁迫响应基因在盐胁迫条件下在野生型和超表达osmyb6基因水稻植株中的表达量。

具体实施方式

以下本发明拟进一步对osmyb6基因的上下游基因及其参与的相关调控信号通路进行分析，并分析osmyb6基因是否具有更广泛的抗旱抗盐作用。通过分析该基因在水稻干旱和盐胁迫调控机理研究及抗旱抗盐品种培育中的作用，以期丰富水稻等禾谷类作物响应干旱和盐胁迫的分子机理积累资料，通过基因工程手段为水稻、小麦等禾谷类作物的抗旱、抗盐分子模块设计育种提供新的基因资源。

水稻转基因株系获得及表型、抗旱和抗盐胁迫分析实验

1材料与方法

1.1植物材料及种植方式

供试的水稻品种为水稻粳稻品种中花11即水稻(oryzasatival.)cv.中花11，保存在周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室。新收的种子种植前先用质量百分比浓度为5%次氯酸钠消毒40min或者用1/1000的多菌灵消毒12h，再用0.1mol/lhno3（1ml63%的浓hno3加入100ml水）浸种16h，自来水冲洗干净后将消毒后的种子置于28°c环境下浸种1d，然后将种子均匀的平铺在培养皿中，其中培养皿中放置一层滤纸，并用水湿润；盖上盖子，然后放入32°c下培养，每天换水两到三次，看到大多数种子破壳出根后转入30°c下培养。保存半年以上的种子播种前先晒种2d，消毒后浸种，消毒方法：55°c温汤浸种30min，待水稻芽长到4.8-5.2mm长的时候播种到纱窗布上（水稻营养液中培养），3叶期后，将水稻幼苗移入土壤中并做好对应的标签进行表型观察和后续的试验分析。水稻每间隔8或者10d进行一次施肥。

1.2所用试剂及载体

本实验所采用的大肠杆菌为dh5α，农杆菌为eha105，这些菌株为周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室保存，植物表达载体为pcambia1301；其中，限制性内切酶、克隆载体pmd18-t、t4dna连接酶、taqdna聚合酶购自于takaba生物公司；dna回收试剂盒为magen生物公司产品；潮霉素（hyg）、卡那霉素（kan）和氨卡霉素（amp）等购自北京鼎国生物技术有限公司，试验所有引物均由北京奥克鼎盛生物公司合成。

1.3rna的提取、cdna合成和rt-pcr扩增目的基因

rna提取使用magen公司的植物rna提取试剂盒，参考方法为较易提取植物组织rna小量提取法。以1μg的rna做模板，按照cdna合成试剂盒（takara）操作说明合成第一链cdna。根据osht1基因cdna全长序列设计特异引物，特异引物序列见表1。rt-pcr反应体系（20μl）：10×pcr反应缓冲液2µl，dntp（2.5mmol/l）1µl，引物（10pm/μl）各1µl，taq聚合酶（5u/µl）0.2µl，模板cdna2µl，ddh2o12.8µl。pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

1.4osmyb6基因表达模式分析

组织特异性表达分析如下：选用2周老的野生型水稻幼苗根、茎、叶，花和授粉后7天的种子用于表达模式分析，如图1所示。非生物胁迫表达模式分析如下：盐胁迫条件如下，首先将水稻幼苗在yoshida营养液中生长，2周后将水稻幼苗放入含有150mmnacl水稻yoshida营养液中生长，分别取0h,3h,6h和12h第三片叶进行rna提取和表达分析，如图3所示；干旱胁迫条件如下，首先将水稻幼苗在yoshida营养液中生长，2周后将水稻幼苗放入含有20%peg2000水稻yoshida营养液中生长，分别取0h,3h,6h和12h第三片叶进行rna提取和表达分析，如图2所示。osmyb6基因表达量检测选用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)。用于qrt-pcr分析的引物根据基因全长序列设计，选用水稻的ubiquitin1(ubi1;os06g0681400)作为定量pcr内参引物(表2)。

1.5osmyb6基因植物表达载体的构建

目的基因的pcr产物，按照宝生物（takara）agarosegeldnapurificationkit试剂盒操作进行纯化。限制性内切酶kpni和xbai双酶切连接有目的基因片段的pmd18-t质粒或pcambia1301质粒后，用t4dna连接酶将目的基因连接到植物表达载体pcambia1301上，反应体系如下：t4dna连接酶（5u/µl）1μl，10×buffer1μl，目的基因片段5μl，pcambia1301载体3μl；反应条件：16℃，2h。连接产物转化感受态e.colidh5α，涂布lb平板（50mg/lkan）培养，37℃过夜倒置培养形成单菌落。

1.6osmyb6基因植物表达载体的鉴定

挑取osmyb6基因植物表达载体质粒转化e.colidh5α后形成的单克隆，提取质粒进行pcr鉴定。阳性质粒转化至感受态农杆菌eah105，涂布lb平板（50mg/lkan、50mg/lrif）培养，28℃倒置培养2d，挑选阳性克隆提取质粒并进行酶切验证。

1.7农杆菌侵染和转基因苗的获得

以水稻愈伤组织为实验材料。osmyb6基因植物表达载体（质粒）通过冻融法转化农杆菌eha105。分别挑取农杆菌（含有osmyb6基因植物超表达载体）单克隆于28℃培养过夜，取10ml培养液，3000rpm，20min，离心收集菌体沉淀，分别重悬于aai溶液（aa培养液，30g/l蔗糖，70g/l葡萄糖，200μmol/l乙酰丁香酮，ph5.2）内，od600=1.0，然后将悬浮液在摇床上28℃振荡培养3-5h。将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液浸染30min；然后将愈伤组织取出，置于灭菌滤纸上沥干50min；将愈伤组织置于共培养基（2n6，10g/l葡萄糖，200μmol/l乙酰丁香酮，ph5.5）上，28℃暗培养3d。三天后用500mg/l头孢美素的灭菌水清洗6遍，100ml灭菌水（包含16μl吐温）清洗5遍，然后用无菌水清洗一遍。将沥干的水稻愈伤转移到筛选培养基（2n6，500mg/l头孢美素，50mg/l潮霉素），28℃暗培养30d。将新长出的抗性愈伤组织转入分化培养基（ms+30g/l蔗糖+30g/l山梨醇+2mg/l6-ba（花之舞用kt）+0.8%琼脂+1.0mg/lnaa+250mg/l头孢霉素+50mg/l潮霉素+2g/l水解酪蛋白，ph5.8）。挑取出现绿芽的水稻愈伤移入装有生根培养基（ms/2+30g/l蔗糖+250mg/l头孢霉素+50mg/l潮霉素）的三角瓶中，放入恒温培养箱28℃光培养15d。准备移栽。首先通过潮霉素抗性基因和gus活性分析对阳性转基因植株进行初步筛选，然后通过qrt-pcr技术检测目的基因在野生型和转基因植株中的表达情况，进一步对初次筛选的阳性植株进行再次筛选。

1.8osmyb6基因在野生型和转基因水稻中的表达情况检测

取14d的野生型和转基因水稻叶片进行rna提取，以1μg的rna做模板，按照cdna合成试剂盒（takara）操作说明合成第一链cdna。以osmyb6基因cdna设计特异定量pcr引物（表2），通过qrt-pcr检测osmyb6在野生型和转基因株系中的表达情况，如图4所示。

1.9osmyb6基因在野生型和转基因水稻中的表型分析

野生型和osmyb6转基因水稻植株萌发后，将幼苗种植到水稻国际yoshida营养液中，12天后进行表型分析，如图5所示。

2.0osmyb6基因转基因水稻干旱胁迫实验分析

野生型和osmyb6转基因水稻植株萌发后，选取2d的生长一致的幼苗并种植在13cm高的圆盆里（里面含有1:3的营养土和蛭石），期间一直保持足够的水。13d后停止浇水进行干旱胁迫处理实验，干旱胁迫25d后进行表型分析，紧接着富水4d，然后统计存活率。并选取干旱胁迫处理20d的地上部分叶片进行生理指标例如电导率、脯氨酸、丙二醛、cat和sod活力检测。每个实验包含三个生物学重复，如图6-12所示。

2.1osmyb6基因转基因水稻盐胁迫实验分析

野生型和osmyb6转基因水稻植株萌发后，选取14d的生长一致的幼苗进行盐胁迫处理实验。方法如下：将生长14d的野生型和转基因植株幼苗放入含有150mmnacl的yoshida营养液，6d后进行表型分析；然后将盐胁迫6d的幼苗放入yoshida营养液中生长，10d后进行表型分析并统计存活率。并选取盐胁迫处理3d的地上部分叶片进行生理指标例如电导率、脯氨酸、丙二醛、cat和sod活力检测。每个实验包含三个生物学重复，如图14-20所示。

2.2非生物胁迫响应基因的表达量分析

选取盐胁迫处理3d的地上部分叶片进行rna提取，保存用于后续定量pcr实验，如图21所示。选取干旱胁迫处理10d的植株叶片进行rna提取，保存用于后续干旱胁迫定量pcr分析实验，如图13所示。rna提取采用的是magen公司rna提取试剂盒，第一链cdna合成采用的是magen公司逆转录试剂盒，定量pcr实验采用的是takara公司定量pcr试剂盒；所有试剂盒实验操作参考试剂盒说明书进行。每个实验包含三个生物学重复，如图21所示。

2.3osmyb6序列对应基因的全长

osmyb6序列对应基因的全长序列为4432bp，其中包含完整读码框序列长度为1344bp，序列如下seqidno.1；

采用ncbiorf-finder预测其编码蛋白质为447个氨基酸，序列如下seqidno.3

根据序列分析，osmyb6为一个功能未知的新的和水稻干旱和盐胁迫相关的基因，尚没有与其同源的任何功能已知的基因被发现。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>周口师范学院

<120>水稻osmyb6基因及其编码蛋白在抗旱和抗盐中的应用

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<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>提高水稻干旱和盐胁迫抗性基因osmyb6的核苷酸序列

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<213>提高水稻干旱和盐胁迫抗性基因osmyb6开放阅读框的核苷酸序列

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<213>提高水稻干旱和盐胁迫抗性基因osmyb6的核苷酸序列编码的蛋白质

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