本发明属于水污染治理技术，具体涉及一种高效脱氮菌的固定化和菌剂包的制备方法与应用。
背景技术：
我国的海水养殖业迅速发展，在满足人们对海产品需求中起了重要作用。然而，在生产过程中，海水养殖区、养殖场产生的大量污染物直接进入海洋环境，长期积累导致水质恶化，海洋生态系统失衡。水产养殖过程中的氮源污染主要来自于人工投饵、动物粪便、残饵以及死亡动植物，以硝态氮和氨氮等形式存在。其存在能破坏鱼类的腮组织，诱发烂鳃病，抑制血液载氧能力，使呼吸机能下降，引起养殖动物缺氧或中毒死亡。为此，控制养殖水体中氮素含量对保证海产品安全，和海洋生态平衡尤为重要。
对于海水养殖环境中氨氮的控制方法，目前主要采用物理法、化学法和生物法。物理法有换水、曝气、沸石粉或壳聚糖吸附等处理方法；化学法包括使用适量生石灰、臭氧、过氧化氢、二氧化氯等化学试剂来降低氨氮浓度；生物法包括微生物、植物和水生动物或者多种生物的联合修复作用等。其中生物法与传统物理化学法相比，具有投资低、环境相容性好、无二次污染、不危害养殖功能等优点，是目前最具发展前景的水体修复技术。
已有专利一体化同步硝化反硝化污水处理装置（cn201510843362.1）提出一体化同步硝化反硝化污水处理装置，该方法同时去除养殖水体中的氨氮和硝酸盐氮，需要微生物的硝化作用和反硝化作用同时配合，其需要多种微生物的联合作用。但该方法处理过程复杂，成本增大。同时，能够去除氨氮的自养氨氧化细菌十分脆弱，容易受环境条件的变化（如：盐度增加）会直接导致其正常的氨氮代谢功能丧失。
因此已有技术的菌株往往不能在高盐条件达到较好的去除效果。尤其是在海水养殖区中。已有专利一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法（cn201510077694.3）公开一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法，但采用该方法得到的菌株不能在高盐条件达到较好的去除效果。尤其是在海水养殖区中，由于氨氮和硝酸盐氮污染主要存在如下两个部分：（1）残余饵料、粪便等有机污染物通过重力沉降到养殖环境底部，然后在较长的时间内，分解产物再从底部向上层水域扩散的高浓度氨氮和硝酸盐氮氨氮和硝酸盐氮；（2）水体中存在的游离的氨氮和硝酸盐氮。
同时，直接使用游离态微生物菌剂易随海水潮汐流动，不能准确定位等使利用效率大大降低，无法满足去除效果造成浪费，并且无法回收、重复使用；海水养殖区水体敏感，外来微生物引入会危及水产养殖产品质量，甚至使其无法正常存活。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高效脱氮菌的固定化菌剂包制备方法与应用，以克服现有技术存在的问题。
本发明的另一目的在于对已有高效脱氮菌的卓贝尔氏菌（zobellellasp.）进行驯化以获得耐盐异养硝化好氧反硝化细菌，并使其在高盐的海水和淡水中均发挥高的污染物去除效率。
本发明的还有一目的在于克服已有直接使用游离态微生物菌剂使用过程中随水流扩散，菌剂使用量大、成本高、利用效率低、且无法回收的诸多缺点。
本发明首先考虑到海水养殖废水的盐度较地表水体高，普通功能微生物无法发挥作用，以及海水养殖区水体敏感，外来的微生物引入会危及水产养殖产品质量，甚至使其无法正常存活；而利用已有的传统物理、化学和生物方法无法达到较好的修复效果，且治理成本高。因此，本发明从海水养殖区沉积物中筛选、驯化的耐盐异养硝化好氧反硝化细菌来处理养殖水体及沉积物中的氨氮和硝酸盐氮，以实现不但处理效果好、费用低，而且因地制宜，不会对原有的生态环境构成威胁。
又，考虑到在流动态的海水中，由于水体的流动，直接使用游离态微生物菌剂易随海水潮汐流动而不能准确定位，因此利用效率低，无法满足去除效果等。所以本发明为首次提出一种用于养殖水体氨氮和硝酸盐氮去除的固定化菌剂包，以便能够保证其内的微生物既不会被水流冲散和单位体积的足够的微生物量的同时，又能对耐盐异养硝化好氧反硝化细菌具有保护作用，从而实现了高效菌剂在海水中有效投加的重要问题，以达到氨氮和硝酸盐氮的切实高效的去除。
本发明的固定化菌剂包是在耐腐、透水土工布袋内平铺均布有若干固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石颗粒，其中改性沸石粒径在3-8mm范围之间，其内的细菌密度为1×109~5×109cfu/ml，该细菌为被驯化的异养硝化好氧反硝化细菌。
上述固定化菌剂包制备方法是首先筛选出高效异养硝化好氧反硝化细菌，然后对异养硝化好氧反硝化细菌进行耐盐性驯化得到耐盐异养硝化好氧反硝化细菌；进而以改性沸石为载体，吸附固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌，得到固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石；最后，将上述固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石平铺于方形土工布袋内，即得到了异养硝化好氧反硝化细菌的固定化菌剂包。
上述的高效异养硝化好氧反硝化细菌的筛选方法，包括如下步骤：
（1）富集培养：称取干重10g-20g的海底沉积物，加入到一个盛有100ml富集培养基的250ml锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后取上清液至分离集培养基中，于上述条件震荡培养数天。然后，取上清液10ml至新鲜的分离培养基，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高异养硝化好氧反硝化细菌的浓度，最终得到异养硝化好氧反硝化细菌富集液；上述富集培养基为：nacl5g；酵母膏5g；胰蛋白胨10g，蒸馏水1000ml，调节ph=8.0，121℃灭菌30min；上述分离培养基为：nacl5g，kh2po41.5g，mgso4﹒7h2o0.01g，na2hpo47.9g，柠檬酸钠5.96g，nano30.4268g，nh4cl0.2686g，微量元素溶液2ml，去离子水1000ml,调节ph=8.0，121℃灭菌30min；上述微量元素溶液为：znso42.2g，cacl25.5g，na2edta63.70g，mncl2·4h2o5.06g，feso4·7h2o5.0g，cuso4·5h2o1.57g，na2moo4·4h2o1.1g，cocl2·6h2o1.61g，去离子水1000ml。
（2）纯化分离：将上述异养硝化好氧反硝化细菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种异养硝化好氧反硝化细菌，上述培养基为：nacl5g，kh2po41.5g，mgso4﹒7h2o0.01g，na2hpo47.9g，柠檬酸钠5.96g，nano30.4268g，nh4cl0.2686g，微量元素溶液2ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节ph=7.2，121℃灭菌30min。
上所述的异养硝化好氧反硝化细菌耐盐性驯化方法，其特征在于，将上述分离得到多株纯种养硝化好氧反硝化细菌挑取到一个新的富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液。待上述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与新富集培养基5%的接种量依次接种于另一个100ml盐度(以nacl计，g/l)为5、15、25、35、45、55、65、75、85和95，初始氨氮和硝酸盐氮添加量均为70mg/l的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮和硝酸盐氮降解效果不低于90%的异养硝化好氧反硝化细菌，即为降解效果好的耐盐异养硝化好氧反硝化细菌。
上述的异养硝化好氧反硝化细菌固定化方法，其特征在于，选择粒径为3-8mm改性沸石颗粒为固定化载体后，取od600=0.6-1.5，密度为1×109~5×109cfu/ml菌液50-100ml，将每克改性沸石加入10-20ml菌液中，28-30℃，150-300rpm振荡吸附12-24h，弃去上清液，用灭菌蒸馏水冲洗改性沸石数次，即得到固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石。
上述的改性沸石，其特征在于，是按每克沸石投加到ph=5的5-10ml磷酸溶液，28-30℃，150-300rpm振荡30-90min，静置12-24h后，采用灭菌蒸馏水冲洗数次；然后采用0.5-1mol/l的fecl3浸泡12-24h后，再用灭菌蒸馏水润洗数次，除去多余fecl3，采用高压灭菌锅于121℃，灭菌30min，即得改性沸石。
上述异养硝化好氧反硝化细菌的固定化菌剂包，其特征在于，将固定化菌剂包覆盖于沉积物-水界面处用于沉积物氨氮去除；堆积或者抛撒置于地表水体、养殖废水、大面积海域中，用于氨氮和硝酸盐氮去除，并且可以活化反复使用。
上述的异养硝化好氧反硝化细菌耐盐性驯化方法中得到的耐盐异养硝化好氧反硝化细菌既可应用于淡水、地表水体氨氮和硝酸盐氮污染水体净化，也可应用于养殖废水、大面积海域，盐度高于30条件下的氨氮和硝酸盐氮污染水体净化。
上述的固定化菌剂包的制备方法，其特征在于上述固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石制备方法中制得的固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石，既可应用于淡水、地表水体氨氮和硝酸盐氮污染水体净化，也可应用于养殖废水、广阔海域盐度高于30条件下的氨氮和硝酸盐氮污染水体净化。
上述的一种异养硝化好氧反硝化细菌的固定化菌剂包制备方法，其特征在于，所述的耐盐异养硝化好氧反硝化细菌为已被驯化的具有耐盐功能，且同步去除氨氮和硝酸盐氮的卓贝尔氏菌zobellellasp.。
显然，本发明圆满地解决了异养硝化好氧反硝化细菌在高盐环境中丧失其发挥作用效果；制成的固定化菌剂包广泛地应用于浅海养殖场和养殖池中，有效地克服了已有直接使用游离态微生物菌剂，存在的易随海水潮汐流动，不能准确定位而利用效率低，大大增加了流动的养殖废水与异养硝化好氧反硝化细菌足够的停留时间，使其充分接触，实现高效去除；并且可以活化固定化菌剂包反复使用，大大降低了成本，因此不但保护了海水养殖区水体生态安全，而且避免了外来微生物引入对水产养殖产品质量的威胁。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
对某海水养殖区沉积物进行采样，通过检测沉积物氨氮浓度达238mg/l，硝酸盐浓度为254mg/l，采用固定化菌剂包在盐度为35‰的条件下对沉积界面进行氨氮和硝酸盐氮抑制实验，包括步骤如下：
首先，筛选出高效异养硝化好氧反硝化细菌：称取干重10g的海底沉积物，加入到一个盛有100ml富集培养基的250ml锥形瓶中，于150r/min，28℃的条件下震荡培养数天后取上清液至分离培养基中，于上述条件震荡培养数天。然后，取上清液10ml至新鲜的分离培养基，于150r/min，28℃的条件下震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高异养硝化好氧反硝化细菌的浓度，最终得到异养硝化好氧反硝化细菌富集液；将上述异养硝化好氧反硝化细菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种异养硝化好氧反硝化细菌
然后，对异养硝化好氧反硝化细菌进行耐盐性驯化：将上述分离得到多株纯种养硝化好氧反硝化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min，28℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液。待上述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与富集培养基5%的接种量依次接种于另一个100ml盐度(以nacl计，g/l)为5、15、25、35、45、55、65、75、85和95，初始氨氮和硝酸盐氮添加量均为70mg/l的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮和硝酸盐氮降解效果好的异养硝化好氧反硝化细菌即为耐盐异养硝化好氧反硝化细菌。挑选出性能较好的细菌，该耐盐异养硝化好氧反硝化细菌为已被驯化的卓贝尔氏菌（zobellellasp.）。
再次，对沸石进行改性：将100g沸石置于500ml磷酸溶液（ph=5）的比例将沸石加入到磷酸溶液，30℃，150rpm振荡30min，静置24h后，沸石用灭菌蒸馏水润洗数次，除去多余磷酸；然后采用1mol/l的fecl3浸泡沸石24h后，用灭菌蒸馏水冲洗洗5次，除去多余fecl3，采用高压灭菌锅于121℃，灭菌30min，得到改性沸石。
对改性沸石进行微生物固定化：选择5mm改性沸石为固定化载体，取500ml菌液（od600=1.5，1.05×109cfu/ml），将30g（干重）改性沸石加入菌液中，30℃，150rpm振荡吸附24h，弃去上清液，用灭菌蒸馏水冲洗改性沸石3次，以除去未吸附的细菌后得到固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石。
选用耐腐、透水无纺土工布制作成袋状，将10g固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石平铺于10cm×10cm的土工布袋内，即得到了异养硝化好氧反硝化细菌的固定化菌剂包，将其覆盖于沉积物-水界面处，以用于沉积物氨氮去除。
本发明利用异养硝化好氧反硝化细菌固定化菌剂包对养殖水体沉积界面进行氨氮和硝酸盐降解试验：取1个固定化菌剂包置于0.25平方的反应器中，在温度为25℃的环境下进行去除实验，结果发现：固定化菌剂包在9天内能够显著抑制水中氨氮和硝酸盐氮的产生，对氨氮的控制率达到73%±17%；对硝酸盐氮的抑制率达68%±6%。
实施例2
对某海水养殖区沉积物进行采样，通过检测沉积物氨氮浓度达46mg/l，硝酸盐浓度为39mg/l，采用固定化菌剂包在盐度为35‰的条件下对水体中的氨氮和硝酸盐氮进行去除实验，包括步骤如下：
首先，筛选出高效异养硝化好氧反硝化细菌：称取干重20g的海底沉积物，加入到一个盛有100ml富集培养基的250ml锥形瓶中，于200r/min，30℃的条件下震荡培养数天后取上清液至分离集培养基中，于上述条件震荡培养数天。然后，取上清液10ml至新鲜的分离培养基，于200r/min，30℃的条件下震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高异养硝化好氧反硝化细菌的浓度，最终得到异养硝化好氧反硝化细菌富集液；将上述异养硝化好氧反硝化细菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种异养硝化好氧反硝化细菌
然后，对异养硝化好氧反硝化细菌进行耐盐性驯化：将上述分离得到多株纯种养硝化好氧反硝化细菌挑取到一个富集培养基中于200r/min，30℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液。待上述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与富集培养基5%的接种量依次接种于另一个100ml盐度(以nacl计，g/l)为5、15、25、35、45、55、65、75、85和95，初始氨氮和硝酸盐氮添加量均为70mg/l的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮和硝酸盐氮降解效果好的异养硝化好氧反硝化细菌即为耐盐异养硝化好氧反硝化细菌。挑选出性能较好的细菌，该耐盐异养硝化好氧反硝化细菌为已被驯化的卓贝尔氏菌（zobellellasp.）。
再次，对沸石进行改性：将100g沸石置于500ml磷酸溶液（ph=5）的比例将沸石加入到磷酸溶液，30℃，150rpm振荡30min，静置24h后，沸石用灭菌蒸馏水冲洗5次，除去多余磷酸；然后采用1mol/l的fecl3浸泡沸石24h后，用灭菌蒸馏水润洗数次，除去多余fecl3，采用高压灭菌锅于121℃，灭菌30min，得到改性沸石。
对改性沸石进行微生物固定化：选择8mm改性沸石为固定化载体，取200ml菌液（od600=1.5，1.05×109cfu/ml），将20g（干重）改性沸石加入菌液中，30℃，150rpm振荡吸附24h，弃去上清液，用灭菌蒸馏水冲洗沸石3次以除去未吸附的细菌后得到固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石。将10g固定化耐盐异养硝化好氧反硝化细菌沸石平铺于10cm×10cm的土工布袋内即得固定化菌剂包，覆盖于沉积物-水界面处用于沉积物氨氮去除。
对养殖水体沉积界面进行氨氮和硝酸盐降解试验：取1个固定化菌剂包置于100ml的反应器中，在温度为25℃的环境下进行去除实验，结果发现：固定化菌剂包在24h内能够显著去除水中氨氮和硝酸盐的产生，对氨氮的控制率达到96%±3%；对硝酸盐氮的抑制率达92%±5%。因此有望对养殖水体得到广泛地应用。