一种基于CD19和BCMA的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于cd19和bcma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用，具体为以肿瘤特异靶点cd19和bcma为基础的嵌合抗原受体t(car-t)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体car由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，car包含抗体的单链片段可变(singlechainfragmentvariable，scfv)区或对肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen,taa)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与t细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与t细胞效应物功能触发(例如cd3ζ)部分串联的t细胞共刺激结构域。car介导的过继性免疫疗法允许car-t移植的t细胞以非hla限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的taa。

大多数患有b细胞恶性肿瘤(包括b细胞急性淋巴细胞性白血病(bcellacutelymphocyticleukemia,leukemia,b-all)和慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia,cll)的患者将由于其疾病而死亡。治疗这些患者的一种方法是通过car的表达，对t细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。car是经设计以人白细胞抗原(humanleukocyteantigen,hla)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达car的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。

cd19分子是治疗b淋巴细胞系肿瘤潜在的靶点，也是car研究中的热点，cd19的表达局限于正常和恶性b细胞，是广泛接受的用来安全测试的car靶标。靶向cd19分子的嵌合抗原受体基因修饰的t细胞(cd19car-t)在治疗多发性、难治性的急性b淋巴细胞白血病上取得巨大成功，而在难治性、复发性慢性b淋巴细胞白血病和b淋巴细胞系淋巴瘤的治疗中疗效明显较差。

cn104788573a公开了了一种嵌合抗原受体hcd19scfv-cd8α-cd28-cd3ζ及其用途，该第二代嵌合抗原受体由抗人cd19单克隆抗体hi19a轻链和重链可变区(hcd19scfv)、人cd8α铰链区、人cd28跨膜区和胞内区、以及人cd3ζ胞内区结构串联构成，该专利中的cd19在进行一次car-t细胞回输后，cd19的表达量会降低，容易逃过免疫机制，而且第二代cart的免疫因子风暴大，有安全性的隐虑。

此外，根据本中心以第四代cd19嵌合抗原受体治疗淋巴瘤的实际统计，在9位病人当中，其中有4位肿瘤组织免疫组化染色cd19强阳性的病人，在接受cd19嵌合抗原受体治疗后都达到完全缓解，另外5位cd19弱表达的病人，只有1位在治疗后达到缓解，其余2位只有部分缓解，1位维持疾病的稳定，1位疾病有进展，此结果反应了单以cd19嵌和抗原受体治疗的困境。

因此，针对cd19阴性复发，以及cd19低表达的b细胞肿瘤，联合另一种潜在的嵌合抗原受体能够解决cd19存在的易突变和表达量低的问题显得尤为重要。除cd19外，bcma亦是治疗恶性b细胞肿瘤的潜力靶点，bcma是一种浆细胞选择性的蛋白，最早发现于成熟的b淋巴细胞表面，在其他组织细胞中几乎不表达，但在恶性增殖的b淋巴细胞(例如骨髓瘤细胞、白血病细胞)中高度表达，同时其介导的下游信号通路，对细胞的存活、增殖、转移和耐药中起着关键性的作用，这些特性使得它成为免疫治疗多发性骨髓瘤及b淋巴细胞系淋巴瘤的一个靶点。抗bcma抗体临床试验的研究显示，bcma已被评估并且确认为治疗b细胞恶性肿瘤的良好标的。

因此，找到一种强特异性、高靶向性，能够有效提高cart治疗效果的嵌合抗原受体就显得尤为重要。

技术实现要素：

针对目前car-t技术治疗肿瘤中单一靶向的长期效果不十分理想，以及肿瘤微环境影响car-t技术治疗效果的情况，本发明提供一种基于cd19和bcma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用，本发明首次联合针对cd19和bcma双重肿瘤靶点，具有强特异性、高靶向性的特点，能够有效的提高且延长cart治疗的效果，针对表面抗原cd19和bcma阳性的白血病或b细胞淋巴瘤有着更好的治疗效果，有效地避免单靶点的脱靶逃逸。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种基于cd19和bcma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞，所述双重嵌合抗原受体包括嵌合抗原受体cd19和嵌合抗原受体bcma。

本发明中，通过将抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原cd19和bcma，再通过慢病毒载体对t细胞进行修饰，从而使得肿瘤表面抗原cd19和bcma能够特异的结合在本申请的嵌合抗原受体上，car-t细胞能够同时消灭cd19和bcma的肿瘤细胞，有效避免肿瘤细胞抗原表达降低而发生逃逸，同时增强car-t细胞的长期免疫效果。

本发明中，所述双重嵌合抗原受体可以是单独的cd19嵌合抗原受体和单独的bcma嵌合抗原受体进行联合使用时，也可以是将cd19嵌合抗原受体与bcma嵌合抗原受体进行联合表达为双重嵌合抗原受体，即抗原结合结构域为能够结合肿瘤表面抗原cd19和bcma，这两种情况都可以实现两种嵌合抗原受体的联合治疗。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、cd3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成。

优选地，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原cd19的单链抗体和针对肿瘤表面抗原bcma的单链抗体。

根据本发明，所述基因修饰改造的t细胞嵌合受体(car)以及针对cd19和bcma抗原结合结构域的单链抗体(scfv)为例叙述如下。

在一个具体的实施例中，所述针对肿瘤表面抗原cd19的单链抗体的氨基酸序列具有(i)、(ii)或(iii)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(i)具有如seqidno.1所示的氨基酸序列；

(ii)与seqidno.1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；

(iii)与seqidno.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

所述氨基酸序列具有针对肿瘤表面抗原cd19的单链抗体的活性；

针对肿瘤表面抗原cd19的单链抗体的氨基酸序列(seqidno.1)如下：diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitgstsgsgkpgsgegstkgevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss.

根据本发明，所述其具有90％以上同源性的氨基酸序列或经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列可以由其它单链抗体或人源化cd19单链抗体替代，其氨基酸突变体，仍然具有cd19单链抗体的的功能。

在一个具体的实施例中，所述针对肿瘤表面抗原bcma的单链抗体的氨基酸序列具有(i)、(ii)或(iii)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(i)具有如seqidno.2所示的氨基酸序列；

(ii)与seqidno.2所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；

(iii)与seqidno.2所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

所述氨基酸序列具有针对肿瘤表面抗原bcma的单链抗体的活性；

针对肿瘤表面抗原bcma单链抗体的氨基酸序列(seqidno.2)如下：

mlllvtslllcelphpafllipdivltqspaslavslgdratincrasesvsvigahlihwyqqkpgqppklliylasnletgvparfsgsgsgtdftltisslqaedaaiyyclqsrifprtfgqgtkleikgstsgsgkpgssegstkgqvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftdysiqwvrqapgqglewmgwiqtetrepayaydfrgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycaldysyamdywgqgtlvtvss.

根据本发明，所述其具有90％以上同源性的氨基酸序列或经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列可以由其它单链抗体或人源化bcma单链抗体替代，其氨基酸突变体，仍然具有bcma单链抗体的的功能。

根据本发明，所述嵌合抗原受体通过慢病毒载体对t细胞进行基因改造，cd19和bcma双重car-t细胞与肿瘤表面抗原cd19和bcma结合，杀肿瘤效果更强。

根据本发明，所述跨膜结构域为cd28跨膜结构域和/或cd8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。

根据本发明，所述共刺激信号传导区为cd28信号传导结构域、cd27信号传导结构域或cd137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，所述cd28信号传导结构域、cd27信号传导结构域和cd137信号传导结构域的排列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，cd28信号传导结构域和、cd27信号传导结构域和cd137信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本申请采用cd28-cd27的顺序组合。

根据本发明，所述第四代car带有可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域，其氨基酸序列如seqidno.3所示，所述seqidno.3所示的氨基酸序列如下：

gsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas.

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2a序列与cd3ζ信号传导结构域相串联，所述2a序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过注入激活剂，从而使得可诱导自杀融合结构域激活，从而导致表达嵌合抗原受体的t细胞死亡而失去作用。

根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽为secretory信号肽，所述secretory信号肽为gmcsfr基因的信号肽，其氨基酸序列可以如seqidno.8所示如下：mlllvtslllcelphpafllip.

优选的，所述secretory信号肽为cd8a基因的信号肽，所述secretory信号肽的氨基酸序列如seqidno.9所示如下：malpvtalllplalllhaarp.

本发明的嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、cd3ζ信号传导结构域、2a序列和可诱导自杀融合结构域串联而成。

作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为secretory信号肽、cd19抗原结合结构域和/或bcma抗原结合结构域，cd8α和/或cd28跨膜结构域，cd28细胞外信号传导结构域、cd28细胞内信号传导结构域、cd27细胞内信号传导结构域，cd3ζ细胞内信号传导结构域、2a序列和fbkp.casp9结构域串联而成，具体排列如下：

secretory-cd19scfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9；

secretory-bcmascfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9。

在一个具体的实施例中，所述嵌合抗原受体secretory-cd19scfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的氨基酸序列如seqidno.4所示或与其具有90％以上同源性的氨基酸序列，所述seqidno.4所示的氨基酸序列如下：

mlllvtslllcelphpafllipqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvrqapgqglewmgwintytgeptyadafkgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycardygdygmdywgqgttvtvssgstsgsgkpgssegstkgdivmtqspdslavslgeratincrasksvstsgysfmhwyqqkpgqppklliylasnlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqhsrevpwtfgqgtkveikaaaievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsasggggsggggsqrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacspggggsggggsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprtsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas；

在一个具体的实施例中，所述嵌合抗原受体secretory-cd19scfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的核苷酸序列如seqidno.5所示或与其具有95％以上同源性的核苷酸序列，所述seqidno.5所示的核酸序列如下：

atgctgctgctggtcacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgacagagtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaaacccgacggcaccgtgaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagcagattttctggcagcggatctggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgctacctacttctgtcagcagggcaacaccctgccctacaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcaccggcagcaccagcggctccggcaagcctggatctggcgagggcagcaccaagggcgaagtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtcgcccctagccagagcctgtccgtgacctgtaccgtgtccggcgtgtccctgcccgactacggcgtgtcctggatcagacagccccccagaaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagacaacctactacaacagcgccctgaagtcccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgacagtctcttctgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccctgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccgctagcggaggtggaggttctggaggtggtggaagtcaaagaaggaagtaccgcagcaacaaaggagaatctcccgtcgagccagccgagccctgtcattattcatgcccaagggaggaggagggaagtacaatcccaattcaagaagactacaggaagcccgaacctgcatgcagtccaggtggaggcggttctggaggcggtggctcccgggtgaaattctcacggtctgcagacgcacccgcttaccagcaaggccagaaccaactctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcactagtggctccggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcccatgggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagtggactcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaggtggaggcggttcaggcggcggcggcagcggcgccatggtcggtgctcttgagagtttgaggggaaatgcagatttggcttacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctcattatcaacaatgtgaacttctgccgtgagtccgggctccgcacccgcactggctccaacatcgactgtgagaagttgcggcgtcgcttctcctcgctgcatttcatggtggaggtgaagggcgacctgactgccaagaaaatggtgctggctttgctggagctggcgcggcaggaccacggtgctctggactgctgcgtggtggtcattctctctcacggctgtcaggccagccacctgcagttcccaggggctgtctacggcacagatggatgccctgtgtcggtcgagaagattgtgaacatcttcaatgggaccagctgccccagcctgggagggaagcccaagctctttttcatccaggcctgtggtggggagcagaaagaccatgggtttgaggtggcctccacttcccctgaagacgagtcccctggcagtaaccccgagccagatgccaccccgttccaggaaggtttgaggaccttcgaccagctggacgccatatctagtttgcccacacccagtgacatctttgtgtcctactctactttcccaggttttgtttcctggagggaccccaagagtggctcctggtacgttgagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcactctgaagacctgcagtccctcctgcttagggtcgctaatgctgtttcggtgaaagggatttataaacagatgcctggttgctttaatttcctccggaaaaaacttttctttaaaacatcagctagttaa.

在一个具体的实施例中，所述嵌合抗原受体secretory-bcmascfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的氨基酸序列如seqidno.6所示或与其具有90％以上同源性的氨基酸序列，所述seqidno.6所示的氨基酸序列如下：

mlllvtslllcelphpafllipdivltqspaslavslgdratincrasesvsvigahlihwyqqkpgqppklliylasnletgvparfsgsgsgtdftltisslqaedaaiyyclqsrifprtfgqgtkleikgstsgsgkpgssegstkgqvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftdysiqwvrqapgqglewmgwiqtetrepayaydfrgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycaldysyamdywgqgtlvtvssaaaievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsasggggsggggsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelggggsggggsggggsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprtsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas；

在一个具体的实施例中，所述嵌合抗原受体secretory-bcmascfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的核苷酸序列如seqidno.7所示或与其具有95％以上同源性的核苷酸序列，所述seqidno.7所示的核酸序列如下：

atgctgctgttggtgacatctttgttgttgtgcgaattgcctcatcccgctttcctgctgattcccgacatcgttctgacccagtctcctgcatctctcgccgtttctctcggtgaccgcgctacaatcaattgcagagcctcagaaagcgtctccgttatcggcgctcacctgattcattggtatcaacagaagccaggccagccacccaaactgctcatctacctggcatccaacctggaaactggtgtgccagccaggtttagcggatcaggaagcggtactgacttcactctgactatctcctccctgcaagccgaagatgcagccatctattactgcctccagagcagaatcttccctagaaccttcggccaaggtactaagctggagattaaaggctccactagcggttccggcaagcccggttccagcgaaggaagcactaagggacaggtccagttggtgcagagcggatctgagctgaagaaacctggcgcctcagtcaaggtttcatgtaaggcatccggatacactttcacagattatagcatccagtgggtccgccaggctcctggtcagggcttggaatggatgggttggattcaaaccgaaacccgcgagcctgcctatgcttacgacttccgcggaagatttgtgtttagcctcgacactagcgtgtctacagcctacctccaaatctcatccctgaaggctgaagacaccgcagtttactactgtgccctcgactactcctatgctatggattactggggtcaaggaactttggttactgtgtctagcgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccctgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccgctagcggcggaggtggctctggcggtggcggatcagttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgggcggcggcggcagcggaggcggtggcagcggcggcggcggctctagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcactagtggctccggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcccatgggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagtggactcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaggtggaggcggttcaggcggcggcggcagcggcgccatggtcggtgctcttgagagtttgaggggaaatgcagatttggcttacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctcattatcaacaatgtgaacttctgccgtgagtccgggctccgcacccgcactggctccaacatcgactgtgagaagttgcggcgtcgcttctcctcgctgcatttcatggtggaggtgaagggcgacctgactgccaagaaaatggtgctggctttgctggagctggcgcggcaggaccacggtgctctggactgctgcgtggtggtcattctctctcacggctgtcaggccagccacctgcagttcccaggggctgtctacggcacagatggatgccctgtgtcggtcgagaagattgtgaacatcttcaatgggaccagctgccccagcctgggagggaagcccaagctctttttcatccaggcctgtggtggggagcagaaagaccatgggtttgaggtggcctccacttcccctgaagacgagtcccctggcagtaaccccgagccagatgccaccccgttccaggaaggtttgaggaccttcgaccagctggacgccatatctagtttgcccacacccagtgacatctttgtgtcctactctactttcccaggttttgtttcctggagggaccccaagagtggctcctggtacgttgagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcactctgaagacctgcagtccctcctgcttagggtcgctaatgctgtttcggtgaaagggatttataaacagatgcctggttgctttaatttcctccggaaaaaacttttctttaaaacatcagctagttaa.

本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为ef1a、cmv-tar或cmv中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到t细胞中表达。

根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mrna序列中的任意一种或至少两种的组合转染到t细胞，优选为通过病毒载体转染到t细胞。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为慢病毒载体。

第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞与包装辅助质粒pnhp和phef-vsvg共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

本发明中，所述重组慢病毒可有效免疫细胞，包括t细胞，能够制备靶向t细胞。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞，293t细胞或te671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供一种药物组合物，包含如第一方面所述的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞和/或如第二方面所述的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的药物组合物在制备嵌合抗原受体t细胞、免疫活性细胞或肿瘤治疗药物中的应用。

本发明中，所述抗原受体t细胞具有良好靶向作用，同时能够释放低剂量免疫因子，具备低毒性反应性质。

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病和/或实体瘤，所述肿瘤疾病选自但不限于白血病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的双重嵌合抗原受体通过对t细胞嵌合受体基因进行特定的改造，基于cd19和bcma的双重car-t细胞与肿瘤表面抗原cd19和bcma结合，杀肿瘤效果更强，肿瘤缩小效果更为明显；

(2)本发明的双重嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原cd19和bcma，cd19和bcma在白血病及淋巴瘤中表达量高，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更安全、更显著的效果，使得car-t细胞的免疫效果增强，不易发生cd19逃逸，更容易到达疾病处，提高了疾病的治疗效果。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体cd19和bcma的合成基因序列图谱；

图2为本发明嵌合抗原受体cd19和bcma联合使用的原理；

图3为cd19和bcma嵌合抗原受体t细胞体外杀伤b细胞淋巴瘤细胞株的流式结果，其中，图3(a)为cd19car-t的实验结果，图3(b)为bcmacar-t的实验结果；

图4为cd19和bcma免疫组化结果，样品为实施例中的dlbcl患者；

图5为cd19和bcma嵌合抗原受体t细胞联合治疗b细胞白血病/淋巴瘤临床实验流程图；

图6为临床联合应用cd19和bcma嵌合抗原受体t细胞治疗b细胞白血病/淋巴瘤患者，回输后患者体内检测的car基因拷贝数。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1嵌合抗原受体的构建

(1)通过全基因合成secretory信号肽、cd19或bcma抗原结合结构域，cd8α和/或cd28跨膜结构域，cd28信号传导结构域、cd27信号传导结构域，cd3ζ信号传导结构域、2a序列和胱天蛋白酶9结构域，如图1所示，即secretory-cd19scfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9及secretory-bcmascfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9；具体序列如下：

secretory-cd19scfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的核苷酸序列如seqidno.5所示。

secretory-bcmascfv-cd28-cd27-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的核苷酸序列如seqidno.7所示。

实施例2慢病毒包装

(1)使用293t细胞，培养17-18小时；

(2)加入新鲜的dmem，内含10％的fbs；

(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取dmem加入helperdnamix(pnhp，phef-vsv-g)以及ptyfdna载体，漩涡振荡；

(4)用superfect或是任何转基因材料加至离心管，室温静置7-10分钟；

(5)将离心管中的dna-superfect混合液逐滴加入至每个培养细胞中，漩涡打匀；

(6)37℃3％co2培养箱里培养4-5小时；

(7)吸走培养基的培养液，用293细胞培养液冲洗培养基，并加入培养液继续培养；

(8)将培养基放回3％co2培养箱中培养过夜，第二天早上用荧光显微镜观察转染效率。

实施例3慢病毒的纯化和浓缩

1)病毒纯化

通过离心1000g，5分钟除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个0.45微米的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；

通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生10⁶到10⁷转导单位滴定的慢病毒载体。

2)用centricon或类似过滤器浓缩慢病毒载体

(1)centricon或类似过滤管中加入病毒上清液，然后在2500g离心30分钟；

(2)震荡过滤管，然后400g离心2分钟，收集浓缩的病毒到收集杯中。最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中。

实施例4car-t细胞的转染

将活化后的t细胞接种到培养皿中，加入浓缩目标基因的慢病毒，以100g离心力的速度，离心100分钟，置于37℃培养24h，加入有细胞培养因子的aim-v培养基，培养2-3天后，将细胞收获并计数，即成为可用之cd19car-t细胞。

实施例5使用cd19和bcmacar-t细胞的体外恶性b细胞株杀伤

(1)从图2可以看出，通过cd19联合bcma能够联合治疗肿瘤，表示本发明选用的双重嵌合抗原受体能够对肿瘤治疗起到明显作用，且防止cd19逃逸。

(2)针对不同b细胞肿瘤的细胞株以流式细胞仪对cd19与bcma的表达进行分析，包含白血病与骨髓瘤细胞株，结果如图3(a)-图3(b)所示，可以看出在不同b细胞肿瘤中cd19与bcma表达程度不一，通过联合cd19与bcmacart的治疗可更有效的针对b细胞肿瘤。

(3)体外评估双重car-t细胞对靶细胞的识别杀伤功能：将非专一性的t细胞、gd2car-t细胞和本申请制备的cd19cart和bcmacart细胞与表达cd19、bcma但不表达gd2之靶细胞，也就是表达gfp之rs4-11人急性淋巴白血病细胞株、骨髓瘤细胞株molp-2(t细胞：肿瘤细胞株＝3:1)，置于37°5％co2培养箱共培养24h；

(4)于培养后24小时记录存活之rs4-11细胞比例，结果如图3(a)-图3(b)所示。相较于对照组t细胞和gd2cart，cd19cart、bcmacart及本发明cd19cart+bcmacart都对rs4-11细胞造成明显的杀伤效。24小时后看来，cd19cart+bcmacart虽然杀伤能力略弱于cd19cart，强于bcmacart。

实施例6cd19和bcmacar-t细胞的临床应用

样本：34岁女性，确诊为弥漫大b细胞瘤一年半，多次化疗后，仍出现淋巴瘤颅内侵犯，后继续化疗，回输前，脑脊液(csf)流式显示有16％单克隆大b淋巴细胞。目前cd19cart已发展多年，对治疗b急性淋巴细胞肿瘤有很好的效果，而在淋巴瘤的治疗上，我们发现未能像白血病一样达到85％以上的完全缓解，许多病人只观察到部分缓解或是只维持肿瘤稳定，于是通过针对过去于本中心进行cd19cart单靶治疗，且由本中心而非第三方机构对其肿瘤进行cd19免疫组化染色的病人进行统计，结果如下表1所示，9位病人当中，有4位cd19强表达的病人都达到完全缓解，另外5位cd19弱表达的病人，只有1位达到完全缓解，其他4位只有部分缓解，维持疾病稳定或是疾病进展，显示了cd19表达强弱影响了cd19cart的治疗效果，针对此一局限，我们想联合其他靶点与cd19cart进行治疗。

表1

备注：n＝9是根据免疫组化表中人数，染过cd19的淋巴瘤病人，只做了cd19单靶点的病人。

实施例7肿瘤细胞的抗原染色鉴定抗原cart靶点

将手术取得的肿瘤组织做固定后，蜡块切片置于玻片上，进行对肿瘤抗原染色，使用cd19以及bcma特异抗体。如图4所示，肿瘤染色面积以百分比表示，强度以0-4+表示，本案例肿瘤表达抗原强度cd19，2+，bcma，4+，说明两种抗原都是好的cart靶向抗原。非特异抗体对照组(isotypecontrol)染色为阴性。

具体临床流程图如图5所示，病人治疗案例具体步骤如下，结果如图6所示：

(1)首先收集患者浓厚白血球液，并自其中分离出cd3阳性t细胞，以实施例4中的方法，制作cart细胞，分为两批，回输患者体内，cd19cart细胞剂量为～1×10⁶cart细胞每公斤体重，bcmacart细胞剂量计为～1×10⁶cart细胞每公斤体重；

(2)回输后三周内有低烧和头痛之轻微crs现象，最高于回输后第14天，外周血中即可测到3.75％cart细胞；回输后第49天，外周血中还可测到1.65％cart细胞，显示cart细胞于体内扩增良好；回输后74天，核磁共振影像(mr)显示胸、腰椎段脊膜增厚程度较前减轻，强化减弱，胸背部皮下肌肉群大片状强化影较前明显缩小；

(3)回输后三个月回访，具体结果如图6中cart拷贝数可以看出，外周血中仍有0.11％cart细胞，通过表2记录了回输后患者的缓解率及生存天数，具体如下：

表2

从表2可以看出，该患者身体好转很多，肺部炎症基本缓解，不依赖吸氧，生理状况良好，暂并未依赖其他药物维持。

综上所述，本发明的双重嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原cd19和bcma，相比于使用其他单一嵌合抗原受体t细胞，联合使用两种car-t细胞使得治疗效果更好，不易发生cd19逃逸，更容易让疾病缓解。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>北京美康基免生物科技有限公司

<120>一种基于cd19和bcma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用

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<212>prt

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20