用于鼻咽癌诊断的生物标志物组合以及应用的制作方法

本发明涉及肿瘤诊断
技术领域：
，具体而言，涉及一种用于鼻咽癌诊断的生物标志物组合以及应用。
背景技术：
：鼻咽癌(鼻咽癌，npc)是由鼻咽部上皮细胞引起的一种癌症，在世界大部分地区相当罕见，发病率低于每10万人1年。然而，它在中国南部、东南亚和北非相当普遍。从人口统计学的趋势来看，男性患该病的可能性是女性的三倍，而发病高峰年龄在50-60岁之间。鼻咽癌与epstein-barr病毒(ebv)感染、遗传易感性、吸烟和饮酒以及环境因素也高度相关。对于鼻咽癌的早期患者，放疗通常是一种有效的治疗方法，而晚期患者的预后通常较差。因此，早期发现有利于提高npc患者的治愈。随着鼻咽癌分子发病机制的迅速发展，已有许多与诊断和预后相关的生物标志物被报道，包括ebvdna、循环micrornas(mirnas)、ebv病毒的mirnas、某些细胞因子和若干甲基化基因。然而，这些分子的检测主要依赖于侵入性样本，如新鲜或福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织、血浆或血清，容易引起患者不适。先前的研究报道，体液中的特异性分子可能与周围组织功能密切相关。唾液是鼻咽部组织附近的一种易于获取的体液，是一种很有前途的用于检测鼻咽癌生物标志物的非侵入性样本。由于血液和组织在循环中的物质交换，以及血液对唾液腺的大量供血，组织和血浆中的分子可能也存在于唾液中。因此，唾液中的分子可用于检测人体全身疾病，特别是唾液腺附近组织的疾病。microrna(mirna)是一类内生的、长度约为18-25nt的非编码rna，在细胞内具有多种重要的调节作用，普遍认为与人类疾病的发生有密切联系。有证据表明，mirna在肿瘤发生中起着类似于癌基因或抑癌基因的重要作用，可被运用到肿瘤的诊断和治疗监测中。mirna在体外很稳定，研究认为循环中mirna主要由细胞分泌释放入血液，以外泌体(exosome)或蛋白复合体的形式存在，能够抵抗rna酶的消化作用和苛刻的条件，从而在细胞之间传递生物信息。已有文献报道了血清或血浆中的特定mirna或mirna组合用于各种癌症的检测中。但唾液中mirna分子用于癌症标志物的检测研究却开展缓慢，且未报道过唾液中mirna分子用于鼻咽癌的检测。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于鼻咽癌诊断的生物标志物组合，该生物标志物组合可用于鼻咽癌的诊断，具有较好的灵敏度和特异性。本发明的另一目的在于提供检测上述生物标志物组合的试剂，该试剂可以检测样本中的生物标志物。本发明的另一目的在于提供上述的试剂的应用。本发明的另一目的在于提供一种鼻咽癌诊断试剂盒和鼻咽癌诊断芯片。本发明是这样实现的：一方面，本发明提供了一种用于鼻咽癌诊断的生物标志物组合，其包括如下microrna分子(mirna分子)：has-mir-30b-3p、has-mir-1202、has-mir-1321、has-mir-3612、has-mir-4478和has-mir-4730；其中，所述has-mir-30b-3p的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述has-mir-1202的核苷酸序列如seqidno.4所示；所述has-mir-1321的核苷酸序列如seqidno.7所示；所述has-mir-3612的核苷酸序列如seqidno.10所示；所述has-mir-4478的核苷酸序列如seqidno.13所示；所述has-mir-4730的核苷酸序列如seqidno.16所示。本发明的研究发现在鼻咽癌患者和正常对照的唾液中具有差异表达的几种microrna分子，即has-mir-30b-3p、has-mir-1202、has-mir-1321、has-mir-3612、has-mir-4478和has-mir-4730。且通过实验验证，将这几种microrna分子作为鼻咽癌诊断的生物标志物，不仅各单独的microrna分子均表现出良好的特异性和灵敏度(图2-图7)，且将些microrna分子组合(或理解为联合)，其同样也表现出更好的特异性和灵敏度(图8)。基于此，上述的microrna分子，即has-mir-30b-3p、has-mir-1202、has-mir-1321、has-mir-3612、has-mir-4478和has-mir-4730中的任意一种或几种的组合或联合均可以作为鼻咽癌诊断的生物标志物，且检测这些microrna分子的试剂例如引物或探针均可以用于制备鼻咽癌诊断试剂盒或芯片。另一方面，本发明提供了一种用于检测上述生物标志物组合的试剂。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂为具有与所述microrna分子互补的序列的探针；或者，所述试剂为用于检测microrna分子的引物。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述引物包括反转录引物、定量pcr前引物和定量pcr后引物；优选的，检测has-mir-30b-3p的反转录引物序列如seqidno.2所示，定量pcr前引物序列如seqidno.3所示，定量pcr后引物序列如seqidno.21所示；优选的，检测has-mir-1202的反转录引物序列如seqidno.5所示，定量pcr前引物序列如seqidno.6所示，定量pcr后引物序列如seqidno.21所示；优选的，检测has-mir-1321的反转录引物序列如seqidno.8所示，定量pcr前引物序列如seqidno.9所示，定量pcr后引物序列如seqidno.21所示；优选的，检测has-mir-3612的反转录引物序列如seqidno.11所示，定量pcr前引物序列如seqidno.12所示，定量pcr后引物序列如seqidno.21所示；优选的，检测has-mir-4478的反转录引物序列如seqidno.14所示，定量pcr前引物序列如seqidno.15所示，定量pcr后引物序列如seqidno.21所示；优选的，检测has-mir-4730的反转录引物序列如seqidno.17所示，定量pcr前引物序列如seqidno.18所示，定量pcr后引物序列如seqidno.21所示。另一方面，本发明提供了上述试剂在制备鼻咽癌诊断试剂盒或鼻咽癌诊断芯片中的应用。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述鼻咽癌诊断试剂盒的检测样本为唾液。另一方面，本发明提供了一种鼻咽癌诊断试剂盒，其包括上述的试剂。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括如下成分中的一种或多种：逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、ddh2o、荧光染料、taq酶及标准品和对照。另一方面，本发明提供了一种鼻咽癌诊断芯片，所述芯片上固定有检测上述生物标志物的mirna探针。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述mirna探针具有与所述microrna分子互补的序列。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为实施例1中的12个差异表达的mirna的表达图谱。图2为实施例2中的has-mir-30b-3pmirna分子的roc曲线。图3为实施例2中的has-mir-1202mirna分子的roc曲线。图4为实施例2中的has-mir-1321mirna分子的roc曲线。图5为实施例2中的has-mir-3612mirna分子的roc曲线。图6为实施例2中的has-mir-4478mirna分子的roc曲线。图7为实施例2中的has-mir-4730mirna分子的roc曲线。图8为实施例2中的6个mirnas(has-mir-30b-3p，has-mir-1202，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-4478，和has-mir-4730)联合的roc曲线。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1唾液中差异表达mirna的芯片筛选实验1、在取得患者知情同意后，从江苏省肿瘤医院收集10例初次确诊为鼻咽癌患者的唾液样本及10例健康人作为正常对照的唾液样本。唾液取样时间以饭后1小时为准，留取2ml储存于-20℃冰箱中。2、使用mirneasyserum/plasmakit试剂盒(#217184，qiagen，hilden，germany)提取鼻咽癌患者和正常人唾液中的rna，操作步骤按照手册进行，并做了部分修改。(1)将2ml收集的唾液样本与4ml的qiazol裂解液彻底混匀，室温放置5分钟；(2)加入1.1ml的氯仿，彻底混匀，室温放置5分钟；(3)在12000g的条件下，4度离心15分钟；(4)吸出上清约2ml，加入1.5倍体积的100％乙醇(3ml)，温柔混匀；(5)将混合液加入离心柱中，每次加入700μl，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(6)重复(5)的操作，分多次反复将混合液离心完；(7)在离心柱中加入700μl的rwt，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(8)在离心柱中加入500μl的rpe，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(9)在离心柱中加入500μl的80％的乙醇(现配现用)，在8000g的条件下室温离心2分钟，并倒去离出废液；(10)将离心柱放入新的收集管中，开盖，离心机室温全速离心5分钟，用于甩干离心柱膜上的有机溶剂；(11)将离心柱放入新的1.5ml收集管中，27μl的rnase-free水加入膜中央，离心机室温全速离心2分钟，收集溶解了rna的溶液25μl(有2μl死体积)，放入-20℃冰箱收藏待用。3、在发现实验中，可以任选地选择人类unitagtmmirna表达谱芯片检测平台，对样本中差异表达的mirna进行分析。该芯片含有人类2017个mirna来自sangerdatabasev.19.0。(1)将提取得到的20μlrna样品加入到80μl的杂交液中(5×ssc，0.2％sds，100nm专用荧光报告探针，rnase-free水补至80μl)，吹打混匀；(2)将上述液体100μl全部加到unitagtmmirna芯片上，加盖4孔agilent硅化盖玻片(agilent，g2534-60011)，并放入芯片杂交盒中；(3)将杂交盒放入杂交炉(agilent，2545a)中15rpm、44℃杂交过夜，通常杂交时间在16小时；(4)杂交结束后，先在400ml37℃的5×ssc溶液中打开芯片和盖片，然后在400ml37℃的含有0.02％sds的5×ssc溶液中洗涤2次，每次3分钟，之后在400ml27℃的0.2×ssc溶液中洗涤2次，每次3分钟，一共四次洗涤，都是将液体在摇床上以100rpm进行漂洗；(5)将芯片从洗液中取出，在玻片离心机上甩干；(6)芯片用luxscan10k双通道激光扫描仪(capitalbio公司)进行扫描，数据提取用luxscan3.0图像分析(capitalbio公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。4、基因芯片数据扣除背景信号后，用r语言中对数据进行quantile归一化，使用spss19.0软件进行配对t-检验获得p<0.01，差异大于2倍的差异表达基因，并用cluster3.0进行聚类分析。5、利用mirna芯片对10对鼻咽癌患者和正常对照的唾液进行差异表达分析，共筛选出12个差异表达的mirna，分别是has-mir-30b-3p，has-mir-575，has-mir-650，has-mir-937-5p，has-mir-1202，has-mir-1203，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-3714，has-mir-4259，has-mir-4478，和has-mir-4730，且与正常对照相比，在鼻咽癌唾液中上述mirna都下调表达(图1)。实施例2唾液中mirna的qrt-pcr实验1、根据mirna芯片结果，选择芯片结果中信号值大于500的6个mirna用qrt-pcr方法进行进一步的实验。所选择的has-mir-30b-3p，has-mir-1202，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-4478，和has-mir-4730的引物见下表1。对鼻咽癌患者和正常对照的唾液单个个体进行mirna的qrt-pcr检测，在整个研究中实施严格质控，每个样本连续检测三次。表12、在取得患者知情同意后，从江苏省肿瘤医院收集80例确诊为鼻咽癌患者的唾液样本及80例健康人作为正常对照的唾液样本。3、使用mirneasyserum/plasmakit试剂盒(#217184，qiagen，hilden，germany)提取鼻咽癌患者和正常人唾液中的rna，操作步骤按照手册进行，并做了部分修改。(1)将1ml收集的唾液样本与2ml的qiazol裂解液彻底混匀，室温放置5分钟；(2)加入0.54ml的氯仿，彻底混匀，室温放置5分钟；(3)在12000g的条件下，4度离心15分钟；(4)吸出上清约1ml，加入1.5倍体积的100％乙醇(1.5ml)，温柔混匀；(5)将混合液加入离心柱中，每次加入700μl，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(6)重复(5)的操作，分多次反复将混合液离心完；(7)在离心柱中加入700μl的rwt，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(8)在离心柱中加入500μl的rpe，在8000g的条件下室温离心15秒，并倒去离出废液；(9)在离心柱中加入500μl的80％的乙醇(现配现用)，在8000g的条件下室温离心2分钟，并倒去离出废液；(10)将离心柱放入新的收集管中，开盖，离心机室温全速离心5分钟，用于甩干离心柱膜上的有机溶剂；(11)将离心柱放入新的1.5ml收集管中，20μl的rnase-free水加入膜中央，离心机室温全速离心2分钟，收集溶解了rna的溶液18μl(有2μl死体积)，放入-20℃冰箱收藏待用。4、使用primescripttmrtmastermix(cat#rr037a，takara)和反转录引物按操作手册进行逆转录反应。(1)按照下表进行反应溶液的配置，至总体积20μl；成分终浓度体积5×reversetranscriptionbuffer1×4μlhasu6/micrornartprimer(2um)1pmol1μlrnatemplate----5μlprimescriptrtenzymemix1----1μldepcddh2o至20μl(2)将上述配制的反应液用移液器轻轻混匀短暂离心后，37℃反应15分钟，85℃反应5秒，完成后置于冰上，加入20μl的ddh2o稀释待用。5、使用480sybrgreenimaster(cat#04707516001，roche)进行qpcr反应，仪器使用罗氏lightcycler480(roche公司)。(1)按照下表进行反应溶液的配置，至总体积20μl；成分终浓度体积2×real-timepcrmastermix1×10μlhasu6/micrornafprimer(10um)0.5μm1μlhasu6/micrornarprimer(10um)0.5μm1μlcdnatemplate----1μlddh2o至20μl(2)将上述配制的反应液短暂离心后，进行pcr反应，按下述程序进行反应；6、pcr扩增结果用ct值表示，即pcr反应中荧光信号达到所设定阈值时的循环数。唾液样品中的mirna表达量可用方程2-△ct表示，其中△ct＝ctmirna-ctu6。7、采用spss19.0软件进行数据处理，mann-whitneyu检验用于比较鼻咽癌病人组和正常对照组中唾液mirna的表达差异，p<0.01认为有统计学意义。用medcalc15.8软件进行roc曲线分析，并计算出灵敏度和特异性。8、数据分析结果显示，has-mir-30b-3p，has-mir-1202，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-4478，和has-mir-4730的差异表达具有显著性(p<0.01)，且6个mirna的roc曲线下面积(auc)分别如下：has-mir-30b-3p，0.883(95％置信区间，0.755-0.958)，灵敏度81.82％，特异度88.00％；has-mir-1202，0.865(95％置信区间，0.733-0.947)，灵敏度81.82％，特异度88.00％；has-mir-1321，0.831(95％置信区间，0.693-0.924)，灵敏度77.27％，特异度80.00％；has-mir-3612，0.855(95％置信区间，0.722-0.941)，灵敏度77.27％，特异度80.00％；has-mir-4478，0.823(95％置信区间，0.684-0.919)，灵敏度72.73％，特异度80.00％；has-mir-4730，0.852(95％置信区间，0.718-0.938)，灵敏度72.73％，特异度92.00％(图2-7)。这6个mirnas联合起来的auc值可达到0.941，(95％置信区间，0.831-0.989)，灵敏度和特异度分别为95.45％和80.00％(图8)，优于单个mirna。这些结果表明，has-mir-30b-3p，has-mir-1202，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-4478，和has-mir-4730联合起来对鼻咽癌唾液进行检测，对鼻咽癌的诊断具有非常高的灵敏度和特异度。实施例3：人鼻咽癌诊断用qpcr试剂盒上述实施例表明，has-mir-30b-3p，has-mir-1202，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-4478，和has-mir-4730对鼻咽癌唾液检测具有较高的诊断价值(高灵敏度和特异度)，因此可基于has-mir-30b-3p，has-mir-1202，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-4478，和has-mir-4730制作人鼻咽癌诊断用试剂盒。该试剂盒包括has-mir-30b-3p引物、探针；has-mir-1202引物、探针；has-mir-1321引物、探针；has-mir-3612引物、探针；has-mir-4478引物、探针；has-mir-4730引物、探针。引物具体包括反转录引物、定量pcr前引物和定量pcr后引物，如表1所示。当然试剂盒中还应该包括相应pcr反应所需的常规酶和试剂，如逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、ddh2o、荧光染料、taq酶及标准品和对照。引物的设计是本领域常规技术手段，也可设计成其他序列。此试剂盒的价值在于只需要唾液样本，而不需要组织、血液样本，就可以用于鼻咽癌的诊断。实施例4：鼻咽癌诊断用芯片试剂盒同理，基于芯片的mirna检测也可用于鼻咽癌唾液的诊断。通过制作少量探针的芯片，即可检测has-mir-30b-3p，has-mir-1202，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-4478，和has-mir-4730的表达，从而对唾液样本进行鼻咽癌的诊断。1、mirna芯片中所有设计的mirna探针序列与它们对应检测的全长成熟mirna完全互补。检测的mirna包括has-mir-30b-3p，has-mir-1202，has-mir-1321，has-mir-3612，has-mir-4478，和has-mir-4730。此外，设计了2个短寡核苷酸，它们与已知的mirna序列不同源。为了将探针固定化到醛基修饰的玻片表面，这些探针序列的5’端加上15个碱基的polya，并有c6的5’-氨基修饰。寡核苷酸探针在takara合成，溶解在easyarraytm点样溶液中，浓度为20μm。使用smartarraytm点样仪(博奥生物公司)，每个探针重复点样3次。2、唾液的总rna的提取用trizol试剂，小rna用ambion的mirnaisolationkit提取。使用t4rna连接酶标记技术对小rna进行标记，即将1μg的小rna和500ng的5’-phosphate-cytidyl-uridyl-cy3-3’(dharmacon，lafayette)混合，在t4rna连接酶(newenglandbiolabs)作用下进行标记。标记反应在4℃进行2小时。之后用0.3m乙酸钠和2.5倍体积乙醇沉淀，再用乙醇洗涤，干燥后悬浮在50μl含有5×ssc，0.2％sds的杂交缓冲液中。3、芯片杂交在agilent杂交盒(agilent，g2534a)中进行，采用8孔硅化盖玻片(agilent，g2534a-60014)，杂交盒在杂交炉(agilent，2545a)中15rpm、44℃杂交过夜，杂交时间为16小时。4、芯片在37℃的5×ssc溶液中打开芯片和盖片，用0.02％sds的5×ssc洗涤溶液洗涤3分钟，2次，之后在27℃的0.2×ssc溶液中洗涤3分钟，2次。完成后，将芯片从洗液中取出，在玻片离心机上甩干。5、芯片用luxscan10k扫描仪扫描(capitalbio公司)，用luxscan3.0图像分析(capitalbio公司)分析获得的图像。基因芯片数据扣除背景信号后，进行quantile归一化，确定这些mirnas的表达情况，并与对照样品进行比较，根据logistic回归分析方程对提供的人唾液样品进行诊断。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所<120>用于鼻咽癌诊断的生物标志物组合以及应用<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>rna<213>人工序列<400>1cugggagguggauguuuacuuc22<210>2<211>56<212>dna<213>人工序列<400>2gtcgggatccagagcaggtccgagggtacacgttcgctctggatcccgacgaagta56<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3ttagctgggaggtggatg18<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列<400>4gugccagcugcagugggggag21<210>5<211>56<212>dna<213>人工序列<400>5gtcgggatccagagcaggtccgagggtacacgttcgctctggatcccgacctcccc56<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6ctttaggtgccagctgcag19<210>7<211>18<212>rna<213>人工序列<400>7cagggaggugaaugugau18<210>8<211>56<212>dna<213>人工序列<400>8gtcgggatccagagcaggtccgagggtacacgttcgctctggatcccgacatcaca56<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列<400>9ctttagcagggaggtga17<210>10<211>22<212>rna<213>人工序列<400>10aggaggcaucuugagaaaugga22<210>11<211>56<212>dna<213>人工序列<400>11gtcgggatccagagcaggtccgagggtacacgttcgctctggatcccgactccatt56<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列<400>12ttagaggaggcatcttga18<210>13<211>17<212>rna<213>人工序列<400>13gaggcugagcugaggag17<210>14<211>56<212>dna<213>人工序列<400>14gtcgggatccagagcaggtccgagggtacacgttcgctctggatcccgacctcctc56<210>15<211>18<212>dna<213>人工序列<400>15gcctttaggaggctgagc18<210>16<211>23<212>rna<213>人工序列<400>16cuggcggagcccauuccaugcca23<210>17<211>56<212>dna<213>人工序列<400>17gtcgggatccagagcaggtccgagggtacacgttcgctctggatcccgactggcat56<210>18<211>19<212>dna<213>人工序列<400>18ttagctggcggagcccatt19<210>19<211>19<212>dna<213>人工序列<400>19ggaacgcttcacgaatttg19<210>20<211>23<212>dna<213>人工序列<400>20attggaacgatacagagaagatt23<210>21<211>17<212>dna<213>人工序列<400>21agagcaggtccgagggt17当前第1页12