一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法与流程

本发明属于荧光定量rt-pcr检测技术领域，具体涉及一种h5亚型流感病毒的实时荧光定量rt-pcr的检测方法，包括鉴定h5亚型流感病毒的引物对和探针。

背景技术：

禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)为单股负链rna病毒，由8个独立的rna节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的抗原性差异，分为18种ha亚型(h1-h18)和11种na亚型(n1-n11)。

perroncito于1878年在意大利首次报道了h5亚型高致病性禽流感。h5亚型禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击，农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。h5亚型禽流感病毒还可感染人，可造成人的发病和死亡的公共卫生问题。1997年，我国香港地区首次报道禽流感病毒直接感染人至发病和死亡。此次疫情是高致病性h5n1亚型禽流感病毒首次跨越种属屏障，由家禽感染人类，共计报告18例病例，其中6例死亡。2003年初，香港又再次出现2例人感染h5n1高致病性禽流感个案，其中1例死亡。之后的1年多，人感染h5n1高致病性禽流感病例在东南亚地区多个国家相继出现，包括越南、泰国、中国大陆、柬埔寨。世界卫生组织报道，至2014年全球总共发生感染h5n1禽流感的病例达649例，其中死亡385例，死亡率高达59.32％。我国的h5亚型禽流感病毒近年来变异速率加快，我国主要流行是第7分支、2.3.2.1分支和2.3.4.4分支等，实际应用中需要能够检测所有流行毒株的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种h5亚型禽流感病毒的实时荧光rt-pcr检测方法，以实现对h5亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。

本发明首先提供一种检测h5亚型禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定h5亚型禽流感病毒ha基因的引物对h5forward、h5reverse和探针h5probe，其引物对和探针序列信息如下：

正向引物h5forward：

5′-acgtatractayccgcartattca-3′(seqidno:1)

反向引物h5reverse：

5′-agaccagcyaycatgattgcc-3′(seqidno:2)

探针h5probe：

5′-tcaacagtggcgagytccct-3′(seqidno:3)

其中探针的5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记。

本发明再一个方面提供检测临床样品中h5亚型禽流感病毒的荧光定量rt-pcr检测方法，包括如下的步骤：

1)配制荧光定量rt-pcr反应体系

反应液每管25μl，含有2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，5u/μltakaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，10pmol/μlh5forward、h5reverse和h5probe各0.5μl，rnasefreedh2o8.0μl，待检测的样品rna模板2μl。

2)荧光定量rt-pcr反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。

质控标准:阴性对照无ct值并且无扩增曲线；阳性对照的ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。

结果描述及判定:无ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测h5亚型禽流感病毒的方法，以实现对h5亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用taqman荧光探针，避免传统sybrgreen染色法造成的污染和低特异性。

附图说明

图1：h5亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；

图2：本发明引物和探针的灵敏度的检测结果图；

图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图。

具体实施方式

实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr)是在pcr定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对dna模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：h5亚型禽流感病毒检测引物及探针设计与筛选

根据h5亚型禽流感病毒血凝素(ha)编码基因ha基因进行引物设计，通过ncbi查找到4636条公开的h5亚型禽流感病毒的ha基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1476-1680的碱基(参考序列genbank登录号：dq320884)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。

设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物，为提高引物的灵敏度，将上游引物所在区域对应的参考序列第1493位碱基、第1510位碱基和第1521位碱基均设计成简并碱基r，第1515位碱基设计成简并碱基y；将下游引物所在区域对应的参考序列第1645位碱基和第1647位碱基均设计成简并碱基r。引物序列如下：

上游引物h5-f1：5′-araaacggaacgtatractacc-3′(22bp)

上游引物h5-f2：5′-acgtatractayccgcartattca-3′(24bp)

下游引物h5-r1：5′-agaccagcyaccatgattgc-3′(22bp)

下游引物h5-r2：5′-agaccagcyaycatgattgcc-3′(23bp)

设计2条探针进行最佳探针筛选，为提高探针的灵敏度，将探针序列所在区域对应的参考序列第1623位碱基设计成简并碱基y。探针的5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记。修饰后探针序列如下：

h5-p1：5′-hex-ttcaacagtggcgagytccctag-bhq1-3′(23bp)

h5-p2：5′-hex-tcaacagtggcgagytccct-bhq1-3′(20bp)

2对引物和2条探针两两配对形成8个组合进行最佳引物和探针组合筛选。

组合1：h5-f1、h5-r1和h5-p1

组合2：h5-f1、h5-r2和h5-p1

组合3：h5-f2、h5-r1和h5-p1

组合4：h5-f2、h5-r2和h5-p1

组合5：h5-f1、h5-r1和h5-p2

组合6：h5-f1、h5-r2和h5-p2

组合7：h5-f2、h5-r1和h5-p2

组合8：h5-f2、h5-r2和h5-p2

引物对和探针的筛选包括如下步骤

1)配制荧光定量rt-pcr反应体系

反应液每管25μl，含有2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，5u/μltakaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，10pmol/μlh5forward、h5reverse和h5probe各0.5μl，rnasefreedh2o8μl，待检测的样品rna模板2μl。

2)荧光定量rt-pcr反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。

质控标准:阴性对照无ct值并且无扩增曲线；阳性对照的ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。

结果描述及判定:无ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

实验结果表明，相同反应条件，h5组合8的扩增效率优于其他7个组合，因此将h5组合8的引物对和探针作为优选，最终确定的引物和探针的序列信息如下：

正向引物h5forward：

5′-acgtatractayccgcartattca-3′(seqidno:1)

反向引物h5reverse：

5′-agaccagcyaycatgattgcc-3′(seqidno:2)

探针h5probe：

5′-tcaacagtggcgagytccct-3′(seqidno:3)

其中探针的5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记。

实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性

检测灵敏度

设置6组不同浓度的h5亚型禽流感病毒rna模板，进行荧光定量rt-pcr最适条件下的核酸扩增。

参照rna提取试剂盒说明书提取h5亚型流感病毒rna，测定所提取的rna模板原始浓度(1ng/μl)，按照10倍梯度稀释成10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl，10^-4ng/μl，10^-5ng/μl，10^-6ng/μl，分别取2μl作为反应模板，按照前述加样方法进行实时荧光定量rt-pcr核酸扩增。

结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为rna终浓度10^-5ng/μl。

检测特异性

根据前述反应体系添加各组分，h5亚型流感病毒rna模板为1ng，非特异性病毒(h1n2亚型禽流感病毒，h3n2亚型禽流感病毒，h4n2亚型禽流感病毒，h5n1亚型禽流感病毒，h5n2亚型禽流感病毒，h5n6亚型禽流感病毒，h6n2亚型禽流感病毒，h7n3亚型禽流感病毒，h9n2亚型禽流感病毒，h10n2亚型禽流感病毒，h11n2亚型禽流感病毒，新城疫病毒，传染性支气管炎病毒)rna模板分别为1ng。检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。结果显示，除了h5亚型流感病毒rna模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线(h5n1亚型禽流感病毒对应ct值为14.15，h5n2亚型禽流感病毒对应ct值为14.75，h5n6亚型禽流感病毒对应ct值为13.78)，其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对h5亚型禽流感病毒的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。

实施例3：对实际样品的检测应用

1.样品采集：

采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份，其中鸡、鸭、鹅各10份。采用pbs液(ph7.0～7.4，0.01mol/l)作为保存液(含青霉素2000iu/ml、链霉素2000iu/ml、制霉菌素1000iu/ml，bsa5mg/ml)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。

2.样品制备

将棉拭子置于装有1ml样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。

3.核酸提取

参照rna提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照rna。提取的rna须在2h内进行rt-pcr扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。

4.鉴定

4.1对比方法：参考国家标准《gb/t19438.3-2004h5亚型禽流感病毒荧光rt-pcr检测方法》中的荧光rt-pcr检测方法，作为对比方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的h5亚型禽流感病毒荧光rt-pcr检测试剂盒。

4.2样品检测

采用国标方法和本专利方法，同时检测此临床样品。

4.3检测结果

结果显示，采用国标方法鉴定结果为13号临床样品有fam荧光信号，ct值为25.22，判定为h5阳性，其余样品均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为13号临床样品有hex荧光信号，ct值为24.67，判定为h5阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组两种方法均出现相应的荧光信号，结果准确可信。

综上所述，这30份临床样品中，13号样品可以判定为h5阳性，其余样品均为阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定h5亚型禽流感病毒，满足了当前对于h5亚型禽流感病毒检测的需求。

序列表

<110>中国动物卫生与流行病学中心

<120>一种h5亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acgtatractayccgcartattca24

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agaccagcyaycatgattgcc21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcaacagtggcgagytccct20