一种暗色产色链霉菌SICAU417及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种暗色产色链霉菌sicau417及其应用。

背景技术：

青稞是禾本科大麦属作物，裸大麦的一种，在西藏、四川等地广泛种植。产量低，病害多是制约当前青稞种植业发展的主要因素。传统农药、化肥的施用虽然能在较短时间内提高青稞产量，缓解供需矛盾，但会对生态环境造成不可逆破坏。放线菌可以分解多种有机物，调节土壤养分，促使土壤团粒结构的形成以改善土壤，还可分泌植物生长调节剂和抗病活性物质等次生代谢产物促进植物生长，抑制植物病害的发生，因此筛选具有潜在应用价值的高效的放线菌菌剂应用于青稞生产，对于优化青稞栽培上的施肥制度、培肥青稞种植土壤具有重要意义。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组分，在土壤营养元素循环、土壤肥力形成和发展、生态环境改善、植物生长和土传病害防治等方面起着极其重要的作用。土壤微生物数量巨大，是重要的资源微生物库，对耕作、施肥农业措施反映敏感。根际是植物生态系统和土壤生态系统交叉形成的特殊区域，根际微生物包括有益微生物和有害微生物，在土壤生态循环中扮演中重要的角色，与作物的生长和健康密切相关，是获得有益微生物资源的重要源。

青藏高原平均海拔高达4000-5000米，是我国最大、世界上平均海拔最高的高原，被称为“世界屋脊”和“第三极”。青藏高原独特的地理单元和低温、干旱、强紫外线、极碱和极盐的极端环境中孕育着生物多样性丰富的极端微生物，这些微生物所携带的特殊遗传资源赋予其特殊的“抗逆”能力，它们不仅能够推动极端环境物质循环、维护环境健康，而且极端微生物的代谢多样性和基因资源又是生物技术创新的源头。因此以藏区青稞根际土为分离材料，进行根际放线菌的分离筛选对于挖掘新的具有抗病促生复合pgpr功能的微生物菌种资源并应用于高效微生物菌剂的研发具有重要价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从健康青稞根际环境的土壤中分离得到暗色产色链霉菌sicau417(streptomycesphaeochromogenes)及其发酵液和菌剂，该菌该菌具有较广泛的抗菌作用，同时能促进植物生长，兼具“肥药”双效功能，使用该菌制成的微生物肥料对于在农业种植业中减少化学肥料和农药施用具有重要意义。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种暗色产色链霉菌(streptomycesphaeochromogenes)sicau417，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期：2018年10月8日，保藏编号：cctccno：m2018661。

本发明采用抖根法收集采自西藏扎朗随机采集健康青稞根际环境的土壤，剔除青稞残根等杂物后，装入无菌塑料袋内密封带回，袋的内外挂放标签，标明采样地点、采样日期、采样人等相关内容。将土壤进行十倍系列稀释后接种于改良isp5培养基平板中，在28℃导致培养30d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并进行划线纯化，通过分离获得34株菌落形态各不相同的菌株。

所述的暗色产色链霉菌sicau417的生物学特性为：该菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、辣椒疫霉病菌、灰葡萄孢、西瓜枯黄病菌和番茄早疫病菌具有抑制作用，iaa产量大于50mg/l，具有溶磷解钾能力。

所述的暗色产色链霉菌sicau417的16srrna序列如seqidno.1所示。

在本发明的另一方面，还提供了上述所述的暗色产色链霉菌sicau417的菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂。

所述的发酵产物通过以下方法制备：将筛选得到的暗色产色链霉菌sicau417活化后接种于改良高氏一号培养液中，28℃，100r/min的恒温摇床中培养，培养72h后，作为种子液以1:1比例加入改良高氏一号培养基，28℃，100r/min的恒温摇床中培养108h使其活菌数达到10亿以上，取出备用。

在本发明的另一方面，所述的暗色产色链霉菌sicau417或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在植物种植中的应用。所述的植物优选为玉米或青稞。

进一步的，具体应用方法为将暗色产色链霉菌sicau417菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂稀释后，在玉米或青稞种植时进行灌根处理，其中所述的暗色产色链霉菌sicau417菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂中活菌含量大于2×10⁷cfu/ml。

优选的，按50-200比例稀释sicau417菌株发酵液，在玉米盆栽种植时，将sicau417进行灌根处理。

在本发明的另一方面，所述的暗色产色链霉菌sicau417或其菌悬液或其培养液或其发酵产物在作为制备抗病促生型多功能微生物肥料中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的暗色产色链霉菌sicau417不仅可以促进植物的生长，还可以抑制植物病原真菌和细菌的生长，且具备溶磷解钾能力，可用于抗病促生型多功能微生物肥料的制作，改善土壤理化性质，促进植物生长。盆栽实验和大田应用显示sicau417发酵液经清水稀释后，采用灌根的方式对玉米和青稞表现出明显的促生作用，能够明显提高玉米的株高和叶片面积，促进青稞的发育，增加株高和产量。

该菌株具有广泛的抗菌活性，高效溶磷解钾能力，产生iaa，对植物具有明显的促进生长作用，表现出多重生物学功能。同时，该菌株具有较广泛的抗菌作用，能促进植物生长，具有“肥药”兼效功能，使用该菌制成的发酵菌剂对于在农业种植业中减少化学肥料和农药施用具有重要意义。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1暗色产色链霉菌sicau417的分离

利用“抖根法”收集西藏扎朗县的青稞根际土壤，剔除青稞残根等杂物后，装入无菌塑料袋内密封带回，袋的内外挂放标签，标明采样地点、采样日期、采样人等相关内容。

采用稀释平板菌落法进行培养，将收集的土壤进行10倍系列稀释后接种于改良isp5培养基平板中。在28℃培养30d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并进行划线纯化，通过分离获得34株菌落形态各不相同的菌株。

实施例2产吲哚乙酸(iaa)测定

将得到的34株内生放线菌培养到对数期，取菌液50μl于含0.5g/l色氨酸的牛肉膏液体培养基中(约3ml)中，重复3次，28℃140r/min振荡培养1.5天，取50μl于洗净的白瓷板中，加100μl显色剂，25℃下避光30min，如果出现粉红色，表明产生iaa，以没有接菌的含0.5g/l色氨酸的牛肉膏液体培养基为对照。

将产吲哚乙酸的内生放线菌继续在含0.5g/l色氨酸的牛肉膏液体培养基中培养24-48h后，8000r/min离心5min，取上清液2ml加入4mlsalkowski显色剂，25℃下避光30min后，530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以iaa的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算iaa的产量(mg/l)。

结果显示，34株菌中有9株产生iaa，产量大于50mg/l的菌株有3株，其中sicau417菌株iaa产量最高，为57.5g/l。

实施例3溶磷能力测定

将得到的34株菌株点种于pvk培养基平板上，30℃培养72h，记录透明圈直径hd值与菌落直径cd值并计算其比值。34株菌中有8株具溶磷能力，其中菌株sicau417的hd/cd值约1.65。

实施例4抑菌能力测定

以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、辣椒疫霉、灰葡萄孢、西瓜枯黄病菌和番茄早疫病菌为供试病原菌，通过平板拮抗测定分离菌株对病原菌的抑制作用，记录hd值与cd值并计算其比值。

结果显示，34株供试内生放线菌中有6株对上述6种病原菌均表现出不同程度的抑制效果，其中sicau417对辣椒疫霉和灰葡萄孢的hd/cd值分别为2.4和3.2。

实施例5菌株sicau417的鉴定

分离纯化的菌株，经过16srrna基因扩增以及pcr扩增，得到如seqidno.1所示的dna序列。提交ncbi进行比对，发现该菌株sicau417与streptomycesphaeochromogenes的同源性最高，达到99％。根据16srdna序列同源性和形态分析将该菌鉴定为暗色产色链霉菌(streptomycesphaeochromogenes)，因此将本发明的得到的菌株sicau417命名为暗色产色链霉菌(streptomycesphaeochromogenes)sicau417。

基于以上特征，将菌株sicau417鉴定为暗色产色链霉菌(streptomycesphaeochromogenes)。该菌株于2018年10月8日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno：m2018661。

实施例6玉米萌芽试验

将上述筛选得到的暗色产色链霉菌(streptomycesphaeochromogenes)sicau417活化后接种于高氏一号培养液中，28℃，100r/min的恒温摇床中培养，培养108h后，作为种子液以1:1比例加入高氏二号培养基，28℃，100r/min的恒温摇床中培养108h使其活菌数达到10亿以上，取出备用。

取sicau417菌株培养液10毫升用无菌水稀释10倍，以川单系列玉米为供试作物品种，将10粒玉米种子浸泡在稀释10倍后的培养液中30分钟，取出，放置于垫有滤纸的无菌平皿中，在光照培养室中培养5天后进行玉米萌芽率、株高和根长的观测记录并拍照。

表1菌株sicau417对玉米种子萌发的影响

结果如表1所示，结果表明，菌株sicau417能够明显促进玉米种子的萌发及生长，表现为施用该菌株后，玉米幼苗的株高和根长显著高于对照处理。

实施例7玉米盆栽试验

取实施例6制备的sicau417菌株培养液0毫升用无菌水稀释10倍，以川单系列玉米为供试作物品种。将10粒玉米种子于稀释10倍后的培养液中浸泡30分钟，然后翻埋种植于口径25cm、高20cm的营养钵中；同时以清水处理为对照，于室外培养45天后进行观察拍照见图1。结果可见，菌株sicau417对玉米表现出明显的促生效果。

实施例8青稞田间应用

将sicau417菌株接种于麦粒培养基中培养35天，待放线菌菌丝长满麦粒培养基后及时进行青稞田间应用验证。试验地：西藏自治区农牧科学院四号试验地，青稞品种：藏青2000，供试土壤：河谷潮土。当青稞两叶一心时将混合好的pgpr菌剂用足量的水稀释后灌根处理，菌剂用量：500g/亩。其他农业管理措施为常规管理。结果表明施用放线菌sicau417对青稞的成穗数、穗长和亩产量等指标均具有明显促进作用(表2)。

表2pgpr生物菌肥对青稞产量与其因子的影响

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>四川农业大学

<120>一种暗色产色链霉菌sicau417及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1356

<212>dna

<213>暗色产色链霉菌(streptomycesphaeochromogenes)

<400>1

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