本发明涉及检测领域，具体涉及贻贝gstα亚型基因在检测受孔雀石绿污染的水产品中的应用。
背景技术：
水产品是海洋和淡水渔业生产的动植物的统称，如鱼类、虾类、蟹类等。我国既是水产品生产大国，同时也是消费大国。水产品的质量安全不仅关系着我国人民的生活健康，也影响着水产品行业的发展，因此对水产品的质量安全检测具有重要意义。随着农、兽药的滥用及环境污染的日益加剧，生物体持续暴露在多种污染物交叉的环境中，造成了其同时遭受多种污染的现象。目前，对水产品中有毒有害物质的常规检测是各种化学手段，但其只能针对部分有毒有害物质进行检测，并且对被生物体吸收代谢转化成的次级代谢产物无法检测，同时还可能由于漏检某种有毒有害物质而产生严重后果。
与生物体内富集的有毒有害物质的化学测定相比，生物标记在关于有毒污染物对生物体健康的影响方面可以给出更完全的信息，具有更高的灵敏度和可靠性。谷胱甘肽硫转移酶(glutathiones.transferase,gst)是目前广泛研究的生物标记物，gsts是生物体内一组多功能同工酶，其主要作用是催化某些内源性或外来有害物质的亲电基团与还原性谷胱甘肽反应，增加其疏水性使其更容易通过细胞膜而排出体外，因此它在生物体受到杀虫剂、农药、重金属、化学致癌剂等危害时起解毒和抗氧化的功能从而保护生物体。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种贻贝(mytilusgalloprovincialis)gstα亚型基因在检测受孔雀石绿污染的水产品中的应用，即在受污染的水中，污染物孔雀石绿存在的条件下，贻贝gstα亚型基因表达相对更敏感。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
检测贻贝(mytilusgalloprovincialis)gstα亚型基因转录水平的试剂在检测受孔雀石绿污染的水产品中的应用，所述贻贝(mytilusgalloprovincialis)gstα亚型基因的序列如seqidno.9所示；优选的，所述水产品为贻贝(mytilusgalloprovincialis)。
在上述应用中，所述检测贻贝gstα亚型基因转录水平的试剂为针对贻贝gstα亚型基因的特异性探针或针对贻贝gstα亚型基因的特异性引物。
优选地，所述特异性引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
本发明还提供一种用于检测受孔雀石绿污染的水产品的荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒包含检测贻贝gstα亚型基因转录水平的引物对，所述引物对的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因转录水平的引物对。
优选地，所述检测内参基因转录水平的引物对的序列如seqidno.7和seqidno.8所示。
本发明还提供一种检测受孔雀石绿污染的贻贝的方法，包括如下步骤：
1)收集待检测的贻贝；
2)获取步骤1)中贻贝的cdna；所述贻贝的cdna优选为贻贝肝脏组织的cdna；
3)以步骤2)获得的cdna为模板，以贻贝gstα亚型基因特异性片段为靶基因，使用荧光定量pcr检测贻贝gstα亚型基因转录水平表达量；
4)通过贻贝gstα亚型基因转录水平表达量的变化，反映待检测的贻贝是否受到孔雀石绿的污染；
所述贻贝gstα亚型基因的序列如seqidno.9所示。
优选地，检测贻贝gstα亚型基因转录水平的引物对的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
优选地，所述荧光定量pcr检测使用的内参基因为贻贝β-actin基因。
优选地，检测内参基因转录水平的引物对的序列如seqidno.7和seqidno.8所示。
本发明所述方法具有如下有益效果：
本发明通过试验证明，贻贝gstalpha(α)亚型基因、mu(μ)亚型基因和sigma3(σ3)亚型基因中，贻贝gstalpha亚型基因在转录水平上的表达对孔雀石绿的污染最灵敏。本发明为水产品污染，尤其是受孔雀石绿污染的贻贝，提供了新的灵敏性更高的检测方法，有效地提升了食品安全检测能力。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请发明人研究发现，贻贝(mytilusgalloprovincialis)gst不同亚型基因转录水平表达量的变化随不同污染物的变化表现出的敏感性明显不同。
实施例1、引物设计及荧光定量pcr的建立
1、引物设计
靶基因a：通过ncbi获得贻贝(mytilusgalloprovincialis)的gstalpha(α)亚型基因序列(genbank号：jx485635.1，如seqidno.9所示)，利用序列分析软件将其与贻贝其它gst基因序列进行比较，在特异性最高的区域设计pcr扩增靶基因特异性片段用引物，并利用primerpremier5.0软件中的引物分析功能对所设计的引物进行各项参数分析，确定最佳引物，上游引物ra1序列为5’-ttggccggagtagggttaga-3’(seqidno.1)，下游引物ra2序列为5’-ttgaaccatacatgttgtat-3’(seqidno.2),扩增产物大小为187bp。
靶基因b：通过ncbi获得贻贝(mytilusgalloprovincialis)的gstmu(μ)亚型基因序列(genbank号：ky365433.1，如seqidno.10所示)，利用分析软件将其与贻贝其它gst亚型基因序列进行比较，在特异性最高的区域设计pcr扩增靶基因特异性片段用引物，并利用primerpremier5.0软件中的引物分析功能对所设计的引物进行各项参数分析，确定最佳引物，上游引物rb1序列为5’-tggagaagactttgaagatgtcca-3’(seqidno.3)，下游引物rb2序列为5’-tcccaacaagtcatgtttcttggg-3’(seqidno.4),扩增产物大小为193bp。
靶基因ck：通过ncbi获得贻贝(mytilusgalloprovincialis)的gstsigma3(σ3)亚型基因序列(genbank号：jx485638.1)，利用分析软件将其与贻贝其它gst亚型基因序列进行比较，在特异性最高的区域设计pcr扩增靶基因特异性片段用引物，并利用primerpremier5.0软件中的引物分析功能对所设计的引物进行各项参数分析，确定最佳引物，上游引物rc1序列为5’-tagctggggaggaatggcta-3’(seqidno.5)所示，下游引物rc2序列为5’-aataacatcacatctggtat-3’(seqidno.6),扩增产物大小为173bp。
内参基因：贻贝β-actin基因(genbank号:af157491.1)，上游引物lg1序列为5’-cagaaggaaatcacagcacttg-3’(seqidno.7)，下游引物lg2序列为5’-gtccatgttaccaagcacga-3’(seqidno.8),扩增产物大小为270bp。
2、贻贝(mytilusgalloprovincialis)肝脏组织rna提取，反转录合成cdna，放置于-80℃冰箱保存。
3、荧光定量pcr方法的建立
1)利用sybrgreenpcrmastermix(tiangen)试剂盒，在abi7500system上进行荧光定量pcr。
反应体系为：
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
2)pcr反应条件
将配制好的β-actin内参和待测样品的pcr反应溶液置于pcr仪上进行扩增反应。每个样品放3个孔，靶基因和内参基因同时扩增。采用两步法进行荧光定量pcr：95℃预变性10min；95℃30s、60℃30s，40个循环。反应结束后进行溶解曲线分析，从而检验退火温度是否适宜，产物中是否含有引物二聚体。
3)结果
荧光定量pcr扩增曲线的整体平行性较好，曲线拐点清楚，基线平而无上扬现象。各管的扩增曲线平行性较好，表明扩增效率相近，可以用来进行荧光定量pcr，分析基因的表达水平。
荧光定量pcr溶解曲线只有一个峰，这表明基因的特异性扩增效果较好，可以用来进行荧光定量pcr，分析基因的表达水平。
上述结果表明，荧光定量pcr对靶基因a、b和ck扩增平行性和特异性好，可以通过ct值的比较对其进行定量。
实施例2、应用贻贝gst各亚型基因检测受孔雀石绿污染的贻贝
将贻贝(mytilusgalloprovincialis)暴露于1、2.5、5、10、20、30和40μg/l不同孔雀石绿浓度的水中，在经过72h后，分别取经过上述处理的贻贝，利用孔雀石绿酶联检测显示，上述不同处理的贻贝已污染孔雀石绿。提取上述不同处理的贻贝肝脏组织rna并反转录获得cdna，按照实施例1步骤3的方法进行荧光定量pcr，观察贻贝gstalpha亚型基因、mu亚型基因和sigma3亚型基因的相对表达量随孔雀石绿浓度的变化。结果如表1所示。
表1.贻贝gst各亚型基因的相对表达量随孔雀石绿浓度的变化
结果表明：贻贝gstalpha亚型基因、mu亚型基因和sigma3亚型基因中，贻贝gstalpha亚型基因在转录水平上的表达对孔雀石绿的污染最灵敏。尤其是针对低浓度的孔雀石绿(2.5ug/l以下)，gstalpha亚型基因表现出更佳的检测灵敏度；相对而言，在浓度为2.5ug/l以下的孔雀石绿中，gstmu亚型基因和sigma3亚型基因几乎表现不出转录水平的变化。
实施例3、应用贻贝gst各亚型基因检测受溴氰菊酯污染的贻贝
将贻贝(mytilusgalloprovincialis)暴露于0.2、0.5、1、2、4、6和8mg/l不同浓度溴氰菊酯的待测水中，在经过96h后，分别取经过上述处理的贻贝，气相色谱检测显示，上述不同处理的贻贝已污染溴氰菊酯。提取上述不同处理的贻贝肝脏组织rna并反转录获得cdna，按照实施例1步骤3的方法进行荧光定量pcr，观察贻贝gstalpha亚型基因、mu亚型基因和sigma3亚型基因的相对表达量随溴氰菊酯浓度的变化。结果如表2所示。
表2.贻贝gst各亚型基因的相对表达量随溴氰菊酯浓度的变化
结果表明：贻贝gstalpha亚型基因、mu亚型基因和sigma3亚型基因中，贻贝gstmu亚型基因在转录水平上的表达对溴氰菊酯的污染表达最灵敏。尤其是针对低浓度的溴氰菊酯(1mg/l以下)，gstmu亚型基因表现出更佳的检测灵敏度；相对而言，在浓度为1mg/l以下的溴氰菊酯中，gstalpha亚型基因和sigma3亚型基因几乎表现不出转录水平的变化。
实施例4、应用贻贝gst各亚型基因检测受多氯联苯污染的贻贝
将贻贝(mytilusgalloprovincialis)暴露于0.1、0.5、1、2μg/l不同浓度多氯联苯的待测水中，在经过120h后，分别取经过上述处理的贻贝，气相色谱检测显示，上述不同处理的贻贝已污染多氯联苯。提取上述不同处理的贻贝肝脏组织rna并反转录获得cdna，按照实施例1步骤3的方法进行荧光定量pcr，观察贻贝gstalpha亚型基因、mu亚型基因和sigma3亚型基因的相对表达量随多氯联苯浓度的变化。结果如表3所示。
表3.贻贝gst各亚型基因的相对表达量随多氯联苯浓度的变化
结果表明：贻贝gstalpha亚型基因、mu亚型基因和sigma3亚型基因在转录水平上的表达对多氯联苯的污染灵敏度相近。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>贻贝gstα亚型基因在检测孔雀石绿污染的水产品的应用
<130>aj181459
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