一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用的制作方法

本发明涉及一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

母乳是新生儿最好的食物，不但能为新生儿提供最佳的营养，还能为其提供生长发育所需的生物活性物质。这些天然活性物质有利于新生儿肠道内微生物的定殖、免疫系统和系统的成熟以及认知能力的发展。大量研究发现，人乳寡糖（humanmilkoligosaccharides，hmos）是母乳中重要的活性因子，在婴幼儿的健康成长中发挥着极其重要的作用，可促进婴儿肠道益生菌的增殖，抵抗致病菌和病毒的入侵，以及调节免疫系统。以岩藻糖基化寡糖为主的中性寡糖约占90%，其中α-1,2-岩藻糖基化寡糖约占73%，针对其合成的研究具有巨大的科研价值和商业价值。

寡糖的获取可通过分离纯化和/或体外合成，但因其在生物体内含量甚微，分离纯化较为困难，而化学合成方法操作繁琐，涉及大量复杂的化学反应，且产率低下。因此，酶法合成被广泛关注。在酶法合成中，岩藻糖基转移酶是一类非常重要的糖基转移酶，这些酶具有较高的底物特异性和立体选择性，不需要对底物进行化学保护或去保护，其作用是将糖基供体gdp-fucose上的岩藻糖转移到gal上形成α-1,2连接，或者转移到glcnac上形成α-1,3，α-1,4，或α-1,6连接。α-1,2-岩藻糖基转移酶属于糖基转移酶家族11，负责将岩藻糖转移到受体上，形成一个α-1,2-键，这些酶往往表现出广泛的受体特异性，这为其在寡糖的合成中提供了巨大优势。

目前只有来源于嗜热蓝绿藻（thermosynechococcuselongatus）、幽门螺杆菌（helicobacterpylori）和大肠杆菌（escherichiacoli）等的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因能在细菌中活性表达，因此发现高效稳定且有特异性的新型α-1,2-岩藻糖基转移酶具有重要的现实意义。本发明利用pcr技术从嗜热聚球藻thermosynechococcussp.nk55a基因组dna中获得α-1,2-岩藻糖基转移酶基因，并连接到pet15载体中，转化到大肠杆菌bl21(de3)表达系统，对该新型基因进行高效表达，为岩藻糖基化寡糖的大量合成奠定基础。本发明还提供了岩藻糖基化寡糖的配方奶粉，其组分为α-1,2-岩藻糖基化寡糖、脱盐乳清粉、乳糖、植物油、浓缩乳清蛋白粉、低聚半乳糖、低聚果糖、膳食纤维、矿物质预混料、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、维生素预混料、酪蛋白磷酸肽、乳铁蛋白、l-酪氨酸、l-抗坏血酸钠、核苷酸、l-色氨酸、l-蛋氨酸、牛磺酸。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用，能够高效合成岩藻糖基化系列寡糖，以达到制备接近母乳的人乳寡糖婴幼儿配方奶粉的目的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，所述的糖基转移酶氨基酸如seqidno.2所示。

编码所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，核苷酸如seqidno.1所示。

所述基因的制备方法，设计基因扩增引物，上游引物为：gtatactagtagcaagca，下游引物为：ggatccttacagcacggtccaacc；然后以嗜热聚球藻thermosynechococcussp.nk55a（ncbi:nc_023033.1）基因组dna为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得α-1,2-岩藻糖基转移酶基因序列。

一种重组表达载体，包含所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列。

一种基因工程菌，由所述的重组表达载体转化至宿主细胞中获得。

所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：将所述基因工程菌接种至培养基中培养，在异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下表达α-1,2-岩藻糖基转移酶，并采用咪唑梯度洗脱的方法纯化所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶。

所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶在制备α-1,2-岩藻糖基化寡糖中的应用，制备方法如下：利用所述的基因工程菌进行诱导表达，提供gdp-岩藻糖供体底物以及包括单糖或寡糖的受体底物，通过生物酶法合成体系催化岩藻糖残基从所述供体底物转移到所述受体底物，由此获得α-1,2-岩藻糖基化寡糖，所述寡糖包含以下各项的一种或多种：lacto-n-tetraose、lacto-n-neotetraose、galβ1,3galnacαpron3、galβ1,3galnacβpron3、galβ1,3glcnacαpron3、galβ1,3glcnacβpron3、乳糖、乳果糖、d-半乳糖、β-苄基乳糖，以及galβ1,3-为起始的寡糖。

所述gdp-岩藻糖通过在宿主细胞中同时表达的酶或通过宿主细胞的代谢而提供。

利用所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶制备α-1,2-岩藻糖基化寡糖在婴幼儿奶粉中的应用。

所述婴幼儿奶粉，由以下重量百分比的物料组成：α-1,2-岩藻糖基化寡糖0.01-5%、脱脂乳粉10-30%、脱盐乳清粉20-45%、乳糖15-30%、植物油10-30%、浓缩乳清蛋白粉2-10%、低聚半乳糖1-5%、低聚果糖1-5%、膳食纤维0.1-6%、矿物质预混料0.8-1.5%、花生四烯酸0.3-1.8%、二十二碳六烯酸0.2-1.0%、维生素预混料0.1-0.3%、酪蛋白磷酸肽0.10-0.22%、乳铁蛋白0.02-0.1%、l-酪氨酸0.02-0.09%、l-抗坏血酸钠0.03-0.12%、核苷酸0.018-0.05%、l-色氨酸0.01-0.05%、l-蛋氨酸0.01-0.05%、牛磺酸0.01-0.04%，以上原料之和为百分之百。

本发明的优点在于：

1、本发明提供了一种生物酶法制备新型α-1,2-岩藻糖基转移酶的方法，所制备的酶活性高，产率高，该法较现有技术更高效，大幅度降低成本，还可达到规模化生产的需求。

2、本发明提供的婴幼儿配方奶粉添加了由α-1,2-岩藻糖基转移酶制备的寡糖，与现有婴幼儿奶粉相比，更接近母乳，具有调节肠道菌群、抗病毒感染、增强免疫力、减少炎症以及促进婴儿大脑发育的作用，有巨大的商业价值。

附图说明

图1重组质粒pet15b-tnfuct物理图谱。

图2重组质粒pet15b-tnfuct双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，泳道从左至右依次是：pet15b-tnfuct、dnamarker。

图3咪唑梯度洗脱岩藻糖基转移酶sds-page分析，泳道从左至右依次是maeker、0%elutebuffer洗脱状况、8%elutebuffer洗脱状况、10%elutebuffer洗脱状况、20%elutebuffer洗脱状况。

图4以galβ1,3glcnacβpron3为受体底物时反应活性分析。

具体实施方式

实施例1

(1)根据ncbi数据库提供的嗜热聚球藻thermosynechococcussp.nk55a（ncbi:nc_023033.1）基因组dna为模板，设计引物gatccatatgttccagccgctgctggat和aagggatccttacttcttaaccagt，引物委托上海生工生物工程公司合成。以目的基因为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，反应体系为：5×rtaqpcrbuffer10μl；dntp(2.5mmol/l)4μl；上游引物(20mmol/l)1μl；下游引物(20mmol/l)1μl；rtaq酶(2.5u/μl)0.25μl；dna模板1μl；补足去离子水至50μl。pcr扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。得到大小为891bp的目的基因片段(图2)。

将目的基因与质粒pet15b（购于上海生工）均用两种限制性内切酶（ndei和bamhi）酶切。酶切体系为：目的基因与质粒pet15b各0.1μl，ndei和bamhi酶各0.5μl；酶切缓冲液（rbuffer）2μl，另加去离子水补足至20μl，在37℃下进行酶切（约2h）。产物进行琼脂糖凝胶电泳，再用凝胶回收试剂盒回收凝胶上的目的条带。将酶切过的目的基因与载体用dna连接酶连接，反应于金属浴中进行，反应时间不少于7h，获得pet15b-tnfuct(图1)。

(2)用上述将验证正确的重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)中，按如下步骤进行：取大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，冰浴30min融化，吸取50μl感受态细胞与2μl100ng/ml的pet15b-tnfuct质粒混合，42℃热击90s，立即冰浴2min，加入500ml新鲜lb培养基，37℃、100rpm条件下复苏培养45min，之后取80μl菌液涂布于含有氨苄青霉素(100ug/ml)的lb平板，37℃恒温培养箱培养16h后挑取单菌落，pcr鉴定重组子，证明重组表达载体构建成功。

(3)挑取上述平板上的阳性转化子，转接到种子培养基中，置于37℃、200rpm/min摇床上振荡培养17h，得种子液；再以1%(v/v)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于37℃振荡培养，经异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖(iptg)苷诱导，iptg终浓度0.2mmol/l，于18℃诱导22h，转速150rpm。诱导时刻为发酵液od600为0.7。所述种子培养基和发酵培养基为lb培养基。

(4)诱导表达后，将发酵液于4000r/min、4℃离心1h收集菌体。将菌体用10mmph7.0trsi-hc1缓冲液重悬后，以pluson2s/off3s的频率下超声6min中以破碎菌体；将破碎后液体于10000r/min、4℃离心30h去除细胞碎片后收集上清液，利用ni柱亲和层析法纯化得到可溶性岩藻糖基转移酶，咪唑洗脱浓度为200mm。sds-page分析目的蛋白表达情况，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量34.4kd基本一致（图3）。获得的目的蛋白即为α-1,2-岩藻糖基转移酶tnfuct，其氨基酸氨基酸如seqidno.2所示，编码所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，核苷酸如seqidno.1所示。

(5)纯化后的α-1,2-岩藻糖基转移酶tnfuct，以gdp-岩藻糖为供体，岩藻糖基转移酶活性中以galβ1,3glcnacβpron3为受体时反应活性最高，产率高达97-100%。高分辨质谱对产物进行分析，在m/z：635.2(m-h)+有离子峰，反应合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖fucα-1,2galβ1-3glcnacαpron3（图4）。

实施例2在奶粉中的应用

一种人乳寡糖婴幼儿配方奶粉，其配方包括以下原料组分：α-1,2-岩藻糖基化寡糖0.01-5%，脱脂乳粉10-30%、脱盐乳清粉20-45%、乳糖15-30%、植物油10-30%、浓缩乳清蛋白粉2-10%、低聚半乳糖1-5%、低聚果糖1-5%、膳食纤维0.1-6%、矿物质预混料0.8-1.5%、花生四烯酸0.3-1.8%、二十二碳六烯酸0.2-1.0%、维生素预混料0.1-0.3%、酪蛋白磷酸肽0.10-0.22%、乳铁蛋白0.02-0.1%、l-酪氨酸0.02-0.09%、l-抗坏血酸钠0.03-0.12%、核苷酸0.018-0.05%、l-色氨酸0.01-0.05%、l-蛋氨酸0.01-0.05%、牛磺酸0.01-0.04%，以上原料之和为百分之百。其制备过程具体包括以下步骤：

（1）配料：将按预定比例称取的α-1,2-岩藻糖基化寡糖、脱脂奶粉、脱盐乳清粉、乳糖、水解乳清蛋白、浓缩乳清蛋白粉、低聚半乳糖、低聚果糖、矿物质预混料、水解酪蛋白、水溶性维生素预混料、牛磺酸，加入所称物料总量3倍的45℃水中，混合均匀后打入暂存罐ⅰ；将按预定比例称取的植物油和脂溶性维生素预混料混匀后打入暂存罐ⅱ；

（2）均质：将暂存罐ⅰ和暂存罐ⅱ的物料混合，在高压均质机内均质，均质压力为20-22mpa；

（3）杀菌：均质后的物料进行预杀菌，杀菌温度85℃，杀菌时间16s。

（4）浓缩：将物料送入蒸发室进行杀菌浓缩，杀菌温度90℃，杀菌时间24s，第一效蒸发温度70℃，第二效蒸发温度50℃，蒸发压力-0.09mpa，杀菌压力0.03mpa；出料浓度19.0°bé；

（5）喷雾干燥：在压力16mpa，进风温度170℃，排风温度为85℃条件下进行喷雾干燥；

（6）流化床干燥冷却：进行流化床干燥及冷却，控制物料中含水量为3.0wt%，冷却至降温，得基料粉；

（7）混料：按预定比例称取花生四烯酸、二十二碳六烯酸、酪蛋白磷酸肽、乳铁蛋白、l-酪氨酸、l-抗坏血酸钠、核苷酸、l-色氨酸、l-蛋氨酸进行预混后，加入至基料粉中搅拌混匀，即得人乳寡糖婴幼儿配方奶粉；

（8）包装：采用真空充氮包装。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及其在奶粉中的应用

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