本发明采用基于lamp技术的莲藕腐败病病原菌的检测方法，属于生物技术研究领域。技术背景莲藕腐败病又称为莲藕瘟病，是莲藕种植过程中的重要病害之一，藕田发病后通常减产20％，严重的可达60％～80％。本病由真菌尖刀镰孢菌莲专化型侵染引起【fusariumoxysporumschl.f.sp.nelumbicola(nis.&wat.)booth】，病菌以菌丝体及厚垣孢子随病残体在藕田土壤中越冬。病菌在条件合适的时候，从地下茎或根系的伤口侵入，然后在茎内蔓延，使其茎节及根系变色腐烂，并导致地上部叶片、叶柄以及莲蓬枯死。藕田水层浅，且常年连续种植莲藕的田块发病较重；土壤酸性大、通气性差的田块发病重。该病5～6月份到收藕期均有可能发生，7～8月份为盛发期。病害发生早中期叶片整体呈现西瓜皮状，叶片主脉区域质地正常，但主脉间以及叶缘部位呈现烫伤状青枯、变脆，其原因是高温晴天条件下水分不能正常疏导所致；中后期叶片叶缘上表面变灰色，干枯、卷曲；叶主脉部位保持绿色，但主脉间与叶缘症状相似。枯萎症状由叶缘至叶脐逐步发展。此外，叶柄基部横切可见棕褐色病变。莲藕腐败病菌属于土传病原真菌，在侵染初期常没有明显症状。一旦莲藕植株表现出发病症状，再对其进行药剂治疗则为时已晚。因此，对该病的预防以及对其病原菌的早期检测就变得非常重要。lamp(环介导等温扩增，loop-mediatedisothermalamplification)技术于2000年发表在著名生物学杂志《nucleicacidsresearch》上，因为该技术对靶标核酸序列具有高特异性、高敏感性、操作简便等特点，很快就被广泛应用到分子生物学检测领域。目前，在人类临床疾病的诊断、动植物病原微生物的定性定量检测等领域，lamp技术都是一个重要的辅助手段。该技术的原理可以简要的概括如下：至少4种特异引物，分别为fip(上游内部引物)，bip(下游内部引物)，f3(上游外部引物)和b3(下游外部引物)，同时依靠一种高活性链置换dna聚合酶，在65℃的含有必须的离子和底物的反应液中，靶标dna链形成单链置换dna，然后在fip和bip的位置形成颈环结构。利用颈环结构以及链置换dna聚合酶，链置换型dna合成在不停地自我循环，并逐步延长和放大。在dna合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dntps)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生焦磷酸镁沉淀逐步积累，呈现浑浊，最后，通过肉眼或者浊度仪，即可以判断在检测样品当中是否有靶标dna片段。技术实现要素：本发明根据已经公布的14种尖孢镰刀菌(f.oxysporum)的基因组信息，以及6种与尖孢镰刀菌亲缘关系较近的其它镰刀菌属(fusariumspp.)的标准菌株的基因组信息，通过基因组的相互比较，找到了24个在尖孢镰刀菌当中存在，但在其它物种当中不存在的特异核酸位点。进一步对这24个位点进行分析后，我们选择了1个编码推测蛋白的核酸序列，其对应的基因编号为foxg_10191。针对该位点，我们设计一套共6条用于lamp技术检测的引物。经过尝试，该套引物可以在实验室内快速鉴定莲藕腐败病病原菌。相关技术路线如下：1.尖孢镰刀菌的基因组序列比对分析，以及特异性位点的筛选。2.对在尖孢镰刀菌中找到的特异性位点进行alignment分析，并选择出一段大概300bp左右的保守序列。3.对上述保守序列设计引物，相关引物可以在http：//primerexplorerjp/e/网站上进行初步设计，然后根据实际情况，选择出最适合的引物组合。引物包括fip(上游内部引物)，bip(下游内部引物)，f3(上游外部引物)，b3(下游外部引物)，lf(上游环引物)和lb(下游环引物)。4.对适量待检植物组织、土样、培养物，经过研磨后(这里可以用研磨直接研磨，如果有条件，可以采用液氮研磨)，取0.1g(研磨汁液或者粉末)，加入1000μl灭菌ddw混匀，沸水浴10分钟后备用。因lamp检测方法非常灵敏，沸水浴以及前期取样品、磨样品过程中要小心操作，防治样品之间交叉污染。5.上述处理后的基因组dna作为模板，加入含有上述6条引物和链置换dna聚合酶的lamp反应液(lamp变色预混液m1800s)。具体的取样量和操作步骤严格按照lamp反应液的使用说明进行，每次反应都需要设置独立的阳性对照和阴性对照。样品静置于65℃水浴锅中，在15分钟、30分钟以及32-33分钟时分别观察反应管的颜色。如果反应管变成黄色，则说明反应管对应样品当中存在靶标核酸片段。附图说明图1.实例中使用的lamp检测引物图2.实例中lamp检测完成后的结果具体实施方式1.尖孢镰刀菌的基因组序列比对分析从nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)网站上下载14种尖孢镰刀菌的基因组信息，包括4287、mn25、cl57、hdv247、phw808、phw815、fo5176、fom001、fov、ii5、n2、b2、fosc3a、fo47。同时，下载6种其它镰刀菌属的基因组信息，包括f.verti、f.proliferatum、f.graminearum、f.solani、f.pseudograminearum和f.fujikuroi。将上述真菌的基因组信息放入计算机服务器，并利用blast软件包(ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/latest/)进行基因组核酸序列的两两比对分析。找到了24个在尖孢镰刀菌当中存在，但在其它物种当中不存在的特异核酸位点。2.针对特异性位点设计lamp检测专用引物将来自14种尖孢镰刀菌的上述24个位点的核酸序列分别导入clustralw软件当中(https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行序列比对，选择出14个菌株当中保守性最高的几个位点。然后，我们针对其中一个位点(其对应的基因编号为foxg_10191)上的含有231bp个核酸序列的区域进行lamp引物设计。进入http：//primerexplorer.jp/e/网站，选择primerexplorerv5版本，导入需要检测的上述那个231bp的靶标序列，按照网页的提示进行初步设计。然后根据实际情况，在列出的引物当中，选择出一套最适合的引物组合，共6条，包括fip(ctgcgctagaggagtcggacagtcgtggggaattgacgg)，bip(aggaacttgtgactctggcctgaagactcgggtcttatcgga)，f3(tgtccagactgaagacttgc)，b3(ggatccatgctgaaccatcc)，lf(tggagtcgagagggctagatg)和lb(ttaaccctcagtccaagcattc)。考虑到lamp检测非常灵敏，建议引物最好采用准确度较高的page或者hplc方法合成。3.待测样品的准备取0.5克尖孢镰刀菌莲专化型菌株的pda平板培养物，进行研磨(可用研钵直接研磨，如果有条件，最好采用液氮研磨)。因lamp检测方法非常灵敏，研磨过程中所使用的研钵、研磨棒、收集管等都必须提前经过高温灭菌，而且操作要非常小心，防止样品之间交叉污染。建议在研磨的台面上铺一层湿纸巾，以及佩戴一次性手套，研磨完不同的样品后，更换新的湿纸巾和手套。取0.1g研磨后的样品(研磨汁液或者粉末)，加入1000μl灭菌ddw混匀，沸水浴10分钟后备用。4.lamp检测靶标核酸片段按照lamp反应试剂盒(lamp变色预混液m1800s)说明书的要求，将各引物提前溶解并混合，浓度为使用浓度的10倍，然后按照1/10的体积加入含有链置换dna聚合酶的lamp反应液中，然后取25μl分装到每个小离心管中，最后小心加入前期处理好的待测样品上清液1μl，盖紧管盖，轻弹混匀后，用小心低速pcr管离心机离心，将反应液集中至离心管底部。阳性对照为尖孢镰刀菌莲专化型菌株提取的基因组dna的10倍稀释液和100倍稀释液(dna浓度分别为1ng/μl和0.1ng/μl)，阴性对照为番茄基因组dna和灭菌水。样品静置于65℃水浴锅中，在15分钟、30分钟以及32-33分钟时分别观察反应管的颜色。经过30分钟的反应，附图2中可以看出两组阴性对照均为原始的粉红色，而待测样品的提取物以及阳性对照都变为黄色。当前第1页12当前第1页12