一种联合检测miRNA诊断结直肠癌的试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测领域，涉及一种诊断结直肠癌的试剂盒，具体涉及一种通过联合检测血清中mirna来诊断结直肠癌的试剂盒。

背景技术：

肠癌包括结肠癌和直肠癌，结直肠癌(colorectalcancer,crc)是胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率和死亡率均排在第五位。结直肠癌的早诊断、早治疗，能够显著提高结直肠癌的检出率并改善预后。目前，结直肠肿瘤的诊断“金标准”为电子结肠镜检查，但是该方法具有侵入性、成本高、技术要求较高等缺点，并且容易造成出血、穿孔并发症等危险，不宜在人群中进行大范围筛查。当前结直肠癌无创诊断的新技术层出不穷，并由此涌现一批新的诊断标志物。这些标志物与传统的癌胚抗原cea、ca19-9等肿瘤标志物相比，具有更高的灵敏度、特异度、似然比、auc。其中，利用实时定量pcr技术对microrna进行定量测定是当前的研究热点。

microrna(或称mirna)是短链、非编码rna，迄今已发现数千种，是基因表达的重要调控因子，在多种肿瘤的发生、发展过程中起到十分重要的作用。其在血清中稳定性良好，即使反复冻融、室温长时间放置或加入rna酶之后仍可保持含量相对稳定。研究表明，某些microrna可作为早期诊断、判别预后的肿瘤标志物。

技术实现要素：

为了寻找一种非侵入性的无创检测方法来对结直肠癌进行准确诊断，发明人通过meta分析的方法，从数千种microrna中筛选出7种具有高诊断价值的microrna，用实时定量pcr的方法对血清microrna进行定量，找出诊断价值最高的microrna组合。并且以此为基础，建立起一种用于诊断结直肠癌的数理统计模型。具体而言，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于诊断结直肠癌的试剂盒，其包括mir-21-5p检测体系、mir-29a-3p检测体系、mir-92a-3p检测体系、mir-125b-5p检测体系和外参cel-mir-39检测体系，当血清中mir-21-5p、mir-29a-3p、mir-92a-3p、mir-125b-5p相对于外参cel-mir-39的表达量(或称表达水平)mir-21、mir-29、mir-92、mir-125根据公式1.169×mir-21+0.946×mir-29+(-1.897)×mir-92+0.886×mir-125计算的结果高于4.94时，认为患有结直肠癌。

上述试剂盒优选还包括rna提取分离体系，用于从血清中提取分离总rna。该总rna包含了mir-21-5p、mir-29a-3p、mir-92a-3p和mir-125b-5p这4种microrna。

micrornas的定量检测可采用常用的适合于小rna分子检测的方法。比如，上述mir-21-5p检测体系、mir-29a-3p检测体系、mir-92a-3p检测体系、mir-125b-5p检测体系和外参cel-mir-39检测体系中的至少之一采用的定量检测原理是northernblotting、微阵列芯片技术(microarray)、和/或反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)。优选这些检测体系的检测原理都是反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)。

上述mir-21-5p是seqidno:1；mir-29a-3p是seqidno:2；mir-92a-3p是seqidno:3；mir-125b-5p是seqidno:4；cel-mir-39是seqidno:5。

在一种优选的实施方式中，上述试剂盒中的rna提取分离体系是天根生化科技(北京)有限公司的mircute^tmmirna提取分离试剂盒(dp501)。

优选上述试剂盒中的mir-21-5p检测体系、mir-29a-3p检测体系、mir-92a-3p检测体系、mir-125b-5p检测体系和外参cel-mir-39检测体系分别是天根生化科技(北京)有限公司的mirna检测试剂盒。

上述mirna检测试剂盒的操作一般包括如下步骤：

a.使用天根生化科技(北京)有限公司的mircute^tmmirnacdna第一链合成试剂盒(kr201)，对mirna进行加poly尾与逆转录；

b.使用天根生化科技(北京)有限公司的mircute^tm增强型mirna荧光定量检测试剂盒(fp411)，通过实时定量pcr对上述逆转录产物进行扩增，获得每个mirna的ct值，所述ct为反应体系中荧光信号达到阈值的循环数。

在使用上述mirna检测试剂盒之前，优选还包括如下步骤的操作：

1)血清采集与保存。例如，受试者使用bd公司生产的促凝管(黄头管)采集血清2ml，3000×g离心20分钟，可直接用于提取总rna，也可-80℃长期保存。

2)总rna提取。例如，使用天根生化科技(北京)有限公司的mircute^tmmirna提取分离试剂盒(dp501)，提取血清中的总rna。

在获得这些mirnas在血清中的表达水平即表达量后，可以通过如下步骤的操作，推断受试者罹患结直肠癌的可能性：

c.统计分析：采用log10(2^-δct)法进行表达水平分析，其中δct＝(ct目的基因-ct外参基因，其中所述目的基因是指各microrna对应的基因，所述外参基因是指cel-mir-39对应的基因)。log10(2^-δct)为各mirna的相对表达量的值，若表达量的计算值1.169×mir-21+0.946×mir-29+(-1.897)×mir-92+0.886×mir-125＞4.94，基本可以确定患有结直肠癌；若≤4.94，可需结合其他检测手段来诊断；如果计算值很低，大致可以排除结直肠癌。

当使用天根生化科技(北京)有限公司的mirna检测试剂盒通过实时定量pcr对mirna逆转录产物进行扩增时，可以分别使用如下引物对：

扩增mir-21-5p的cdna使用正向引物mir-21-f(seqidno:9)和反向引物mir-21-r(seqidno:10)；

扩增mir-29a-3p的cdna使用正向引物mir-29-f(seqidno:11)和反向引物mir-29-r(seqidno:12)；

扩增mir-92a-3p的cdna使用正向引物mir-92-f(seqidno:13)和反向引物mir-92-r(seqidno:14)；

扩增mir-125b-5p的cdna使用正向引物mir-125-f(seqidno:15)和反向引物mir-125-r(seqidno:16)；

扩增cel-mir-39的cdna使用正向引物cel-mir-39-f(seqidno:17)和反向引物cel-mir-39-r(seqidno:18)。

在一种优选的实施方式中，上述试剂盒的使用说明书中还包括用于统计分析的计算机程序及安装使用说明，从而方便上述log10(2^-δct)法进行mirna表达水平分析和计算公式1.169×mir-21+0.946×mir-29+(-1.897)×mir-92+0.886×mir-125的使用。

本发明的试剂盒通过对血清中mir-21-5p、mir-29a-3p、mir-92a-3p和mir-125b-5p这4种mirnas的表达水平进行数理统计，建立了一种结直肠癌的体外无创诊断方法，检测的敏感度(或称灵敏度)和特异性都较高，可以为结直肠癌的诊断和病程监控提供指导。

附图说明

图1是实施例的血清样本中筛选出的4种mirnas表达量经诊断公式计算后的箱线图。

图2是实施例的血清样本中mirnas表达量检测的roc曲线。

具体实施方式

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

在本发明中，术语“microrna”、“mirna”和“mir”表示相同的意义，可以互换，它们都是指微小rna，即非编码单链rna分子。

本文中，为描述简便起见，将计算公式中mir-21-5p的表达量表示为mir-21，将mir-29a-3p的表达量表示为mir-29，将mir-92a-3p的表达量表示为mir-92，将mir-125b-5p的表达量表示为mir-125；以此类推。

在用mirna检测试剂盒对血清样本中各mirna的表达水平进行定量后，可用数学分析方法进行统计学处理，在此基础上获得具有样本分类意义的分级标准。这样的数学方法优选由计算机完成，比如用这些数据绘制roc曲线，从而对受试者个体的样本进行分类。

roc曲线全称为受试者工作特征曲线(receiveroperatorcharacteristiccurve)，又称为接收者操作特性曲线，主要用于临床生化诊断试验。roc曲线是反映真阳性率(灵敏度，又称敏感性，sensitivity)和假阳性率(1-特异性，specificity)连续变量的综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的分界值(阈值或临界值，cut-offvalue，是划分诊断试验结果正常与异常的界值)作为连续变量，从而计算出一系列灵敏度和特异性，再以灵敏度为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制的曲线，曲线下面积(auc)越大，诊断准确性越高。在roc曲线上，最靠近坐标图左上方的点为灵敏度和特异性均较高的临界值。roc曲线auc值在1.0和0.5之间。在auc＞0.5的情况下，auc越接近于1，说明诊断效果越好。auc在0.5～0.7时有较低准确性，auc在0.7～0.9时有一定准确性，auc在0.9以上时有较高准确性。

roc曲线的评价方法与传统的评价方法不同，根据实际情况，允许有中间状态，可以把试验结果分为多个有序分类，比如：正常、大致正常、可疑、大致异常和异常五个等级。

上述有序分类，对于疾病的诊断而言，可分为：阴性、不确定、阳性。进一步地，对于癌症诊断而言，可分为：癌症、非癌症。

在优选的实施方式中，上述试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是试剂盒、药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频app下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如cd、电脑光盘、u盘等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明的构思之后，本领域技术人员对其作出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。

实施例

实施例中所用的mirna定量检测试剂盒皆由天根生化科技(北京)有限公司提供，pcr所用dna序列和引物由天根生化科技(北京)有限公司合成。按试剂盒说明书操作。

实施例1受试者筛选与样本采集

以2015年7月至9月在复旦大学附属中山医院就诊的85例经手术后病理诊断作为结直肠癌的患者为病例组，84例体检中心进行体检的健康人作为对照组。术前使用bd公司生产的促凝管(黄头管)采集血清2ml，3000×g离心20分钟，可直接用于提取总rna，也可-80℃长期保存。

实施例2血清样本中总rna提取

使用天根生化科技(北京)有限公司mircute^tmmirna提取分离试剂盒(dp501)提取上述血清样本的总rna，具体操作如下：

①吸取200μl血清、200μl裂解液、2μl外参液；混匀30s，静置5min；室温13000g离心10分钟；

②上清液转入新离心管，加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，静置5分钟；室温13000g离心15分钟；取最下面无色的水相层至新离心管；缓慢加入1/3体积无水乙醇，混匀；

③吸附柱spin编号，转入吸附柱，静置2分钟；室温13000g离心30秒；弃去吸附柱spin，保留流出液；缓慢加入2/3体积无水乙醇，混匀；

④吸附柱elute标号，转入吸附柱，静置2分钟；室温13000g离心30秒；保留吸附柱，弃去流出液；

⑤向吸附柱加入250μl去蛋白液mrd；静置2分钟，室温13000g离心30秒，弃流出液；向吸附柱加入300μl漂洗液rw；静置2分钟，室温13000g离心30秒，弃流出液；向吸附柱加入300μl漂洗液rw；静置2分钟，室温13000g离心1分钟，弃流出液；吸附柱放置或通风片刻；

⑥吸附柱转入新离心管，加入20μl无酶水；静置3分钟，室温13000g离心3分钟；

⑦得到＞15μl的rna提取液，继续做poly加尾实验。

实施例3加poly尾与逆转录

使用天根公司mircute^tmmirnacdna第一链合成试剂盒(kr201)进行cdnapoly加尾，具体操作如下：

①0.2ml离心管加入2μl10×polybuffer、4μl5×ratpsolution、13.6μlrna提取液、0.4μlecolipoly聚合酶(最后加聚合酶)，用移液器混匀，短暂离心；37℃下60分钟

②0.2ml离心管加入1μlrnasin、13.5μl加尾液、2μl10×rtbuffer缓冲液、1μlsuperpuredntp、2μl10×rtprimer引物、0.5μlquantrtase，用移液器混匀，短暂离心；37℃下60min；得到mirna的加尾及逆转录产物cdna。

实施例4实时定量pcr和mirna定量分析

实时定量pcr：使用天根公司mircute^tm增强型mirna荧光定量检测试剂盒(fp411)，通过实时定量pcr对cdna进行扩增，具体操作如下：

①加入2μlreverseprimer、2μlmicrorna引物、1.6μl50×rox、10μl2×premix、4.4μlcdna液，混匀；每个样本设置3个副孔。各mirna的cdna的pcr引物序列如表1所示：

表1、mirnas即pcr扩增引物序列

②pcr仪设置如下：94℃2分钟预热，94℃20秒+60℃34秒，共40个循环；

③获得每个样本每个microrna的ct值。

统计分析：采用log10(2^-δct)法进行表达水平分析。反应体系中荧光信号达到阈值的循环数为ct，δct＝(ct目的基因-ct外参基因，其中所述目的基因是指各microrna的基因，所述外参基因是指cel-mir-39对应的基因)。log10(2^-δct)为microrna的相对表达量的值。病例组与对照组差异采用wilcoxon检验。计算每个microrna诊断结直肠癌的灵敏度、特异度、auc。用logistic回归法计算7种microrna联合诊断的系数与p值，排除p值≥0.05的microrna。p值＜0.05视为有统计学显著差异。

实验结果：检测发现，7种microrna(mir-21-5p、mir-29a-3p、mir-92a-3p、mir-125b-5p、mir-223-3p、mir-338-5p、mir-767-3p)在病例组与对照组表达量均具有显著差异。7种microrna单独作为诊断标志物的auc分别为0.918(95％ci0.874-0.963)、0.878(95％ci0.826-0.930)、0.817(95％ci0.752-0.882)、0.864(95％ci0.808-0.921)、0.858(95％ci0.796-0.919)、0.826(95％ci0.764-0.888)、0.767(95％ci0.692-0.842)。经logistic回归计算，mir-21-5p、mir-29a-3p、mir-92a-3p、mir-125b-5p这四种microrna联合，每个microrna的p值均＜0.05。经公式1.169×mir-21+0.946×mir-29+(-1.897)×mir-92+0.886×mir-125计算，4种micrornas联合后auc可达0.952(95％ci0.922-0.982)，cut-off值为4.94，此时灵敏度为84.7％，特异度为98.7％。病例组和健康对照组经公式计算后的箱线图如图1，roc曲线图如图2所示。

对85个结直肠癌病例和84个健康对照例的血清中四种microrna即mir-21-5p、mir-29a-3p、mir-92a-3p、mir-125b-5p相对于外参cel-mir-39的表达量(mir-21、mir-29、mir-92、mir-125)进行了统计，其中外参cel-mir-39的表达量设定为1。通过公式1.169×mir-21+0.946×mir-29+(-1.897)×mir-92+0.886×mir-125进行计算，发现结直肠癌病例的计算值的四分位数范围是6.64～8.11，而健康对照例的计算值的四分位数范围是0.24～2.47。根据该统计结果可知，若受试者血清中mir-21-5p、mir-29a-3p、mir-92a-3p、mir-125b-5p表达量的计算值＞4.94，基本可以确定患有结直肠癌。

实验结果表明，本发明的试剂盒可用于定量检测血清中多种microrna的含量，根据mir-21-5p、mir-29a-3p、mir-92a-3p和mir-125b-5p表达量相对于外参cel-mir-39表达量的计算，能够为肠癌的早期鉴别诊断、病程监控提供有效的参考。

序列表

<110>复旦大学附属中山医院

<120>一种联合检测mirna诊断结直肠癌的试剂盒

<130>shpi1812195

<160>24

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