一种与先天性气管软化相关的CNV片段及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种与先天性气管软化相关的cnv片段及其应用。

背景技术：

气管软化症(tracheomalacia)指气管壁因气管软骨环完整性受到破坏或部分气管壁纵行弹性纤维萎缩或减少，导致气管弹性张力减退而坍塌狭窄的疾病。根据发病原因可将其大致分为先天性(原发性)气管软化(congenitaltracheomalacia,ctm)和获得性(继发性)气管软化两种。目前ctm的发病机制尚未完全阐明，其发病率约为1/2100，占支气管镜检查诊断的34％。ctm以在健康人群中孤立性发现，但更多见于早产儿，发病年龄多在6个月以内。ctm常伴有其他疾病，如先天性心脏病、胃食管反流、tef、支气管肺发育不良、神经功能损害、发育迟缓等，发生率为1.7％-78％。按气管塌陷程度，ctm可分为轻中重三级，其中重度ctm患者以反复感染、肺不张和呼吸困难为主要表现，保守治疗往往无效，在上世纪80年代死亡率高达80％，即使在今天，重度ctm患者也多有痰贮留、上呼吸道梗阻、呼吸停止甚至心脏骤停等症状出现，给家庭和社会带来严重的经济和精神负担。因此，寻找ctm的遗传基础，探索其可能的致病机制显得尤为重要和迫切。

近年来，拷贝数变异(copynumbervariation，cnv)在复杂疾病中的作用受到了日益广泛的关注。cnv是指由基因组发生重排而导致的，一般长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的缺失和重复，是基因组结构变异的重要组成部分据报道cnv可涵盖基因组29.74％的区域，较snp携带有更多的信息，此外cnv位点的突变率也远高于snp，是人类个体之间产生遗传差异及疾病的重要致病因素之一。

目前常用的进行全基因组范围内cnvs研究的是微阵列比较基因组杂交技术(array-basedcomparativegenomichybridization，acgh)和以单核苷酸多态性分型为基础的阵列技术(array-basedsinglenucleotidepolymorphisms，snparray)。对基因组己知的cnv检测主要包括实时荧光定量pcr(real-timeqpcr)、依赖连接的多重扩增探针杂交技术(multiplexligation-dependentprobeamplification，mlpa和短片段多重定量技术(quantitativemultiplexpcrofshortfluorescentfragments，qmpsf)。

特异的cnv可以解释除序列变异外的一部分疾病风险，且已经被证明与多种复杂疾病相关。目前关于cnv与ctm相关性的研究相对较少。本发明拟探讨ctm发病的遗传基础，从分子水平寻找其可能的生物标志物，将有助于ctm的早期诊断和治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与先天性气管软化相关的cnv片段，及其提供上述cnv片段在在制备预防、早期检测或治疗先天性气管软化的产品中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供一种与先天性气管软化相关的cnv片段，所述cnv片段为chr17:16673072-20374018区间片段，所述chr17:16673072-20374018片段在先天性气管软化患者血液中发生拷贝数缺失。

优选的，所述cnv片段包含aldh3a1、atpaf2、akap10、drg2、fam106a、fam83g、llgl1、rai1、slc47a1、srebf1、tbc1d28基因。

优选的，所述的cnv片段在制备预防、早期检测或治疗先天性气管软化的产品中的应用。

优选的，所述产品包括试剂盒、试剂或药品。

进一步地，本发明提供一种检测先天性气管软化的试剂盒，所述试剂盒包括特异性检测chr17:16673072-20374018区间片段或该区间片段所包含基因cnv的引物。

优选的，所述特异性检测chr17:16673072-20374018片段或该区间片段所包含aldh3a1、atpaf2基因cnv的引物，所述aldh3a1引物的核苷酸序列如seqidno.1-4所示，所述atpaf2引物的核苷酸序列如seqidno.5-8所示。

优选的，所述试剂盒还包括10×pcr缓冲液，taqdna聚合酶，dna模板，dntp，mgcl2和正常样本基因组dna。

优选的，所述试剂盒通过实时荧光定量pcr检测chr17:16673072-20374018片段或该区间片段所包含基因的拷贝数的高低来初步检测是否患有先天性气管软化疾病。

优选的，所述检测具体包括：以待测样品的基因组dna为模板，利用如seqidno.1-8所示的引物与内参基因引物进行荧光定量pcr反应，利用方法计算待测样品cnv片段的拷贝数与正常对照组相比，比值在0.5～1.5范围范围内提示正常，比值<0.5提示有片段缺失，比值>1.5提示有片段重复。

优选的，当检测待测样品chr17:16673072-20374018或aldh3a1、atpaf2基因拷贝数缺失时，初步检测患有先天性气管软化疾病。

有益效果

本发明对先天性气管软化患者的基因的拷贝数进行检测，并通过荧光定量pcr进行验证，结果发现，先天性气管软化患者chr17:16673072-20374018或aldh3a1、atpaf2基因的拷贝数显著低于正常人(p<0.05)。因此，chr17:16673072-20374018或aldh3a1、atpaf2基因的拷贝数变异位点可以作为先天性气管软化病早期筛查和诊断的分子标记。

本发明提供的一种检测先天性气管软化的试剂盒，所述试剂盒包括检测chr17:16673072-20374018或aldh3a1、atpaf2基因拷贝数变异的检测，此试剂盒可用于初步检测待测样品是否患有先天性气管软化疾病。

附图说明

图1为先天性气管软化aldh3a1、atpaf2基因拷贝数。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1样本收集

1、ctm患者的纳入排除标准

(1)中国汉族患者，年龄不超过1岁；

(2)在结合病史、查体及纤维支气管镜检查的基础上，由两位以上经验丰富的高年资专科医师一致诊断为ctm，气管塌陷程度为重度(即看不到圆形管腔)；

(3)排除继发性tm，排除其他原因导致的气管损伤者；

(4)排除其他系统(如心脏、食管)畸形；

(5)排除其他已知临床综合征；

(6)排除合并有恶性肿瘤的患者

(7)排除母亲孕期有明确用药史、毒物接触史、高温暴露史者；

(8)排除流行病学资料、临床资料和影像资料不完整者；

(9)排除未获得知情同意者。

2、正常对照(包括核心家系中的父母)的纳入排除标准

(1)正常中国汉族儿童，年龄不超过1岁，性别比例与患者组相匹配，所有样本来源于健康体检儿童；核心家系中父母均为中国汉族人群，经常规影像及生化检测无明显器质性或精神性病变；

(2)所有对照的资料经两位高年资专科医生盲法评估为非ctm；

(3)排除明确的其他疾病家族史；

(4)无头颈部其他疾病史，目前未服用任何药物；

(5)核心家系中父母于采血前2周内未吸烟、饮酒、熬夜、服用刺激性食物等。

严格按照纳入排除标准采集样本资料，收集2017年5月-2018年8月就诊于首都医科大学附属北京儿童医院儿童呼吸科的8例表型典型的患者及其父母(核心家系)的外周血6-8ml。签订知情同意书。

实施例2ctm核心家系全基因组cnv扫描及数据分析

选择8例表型典型的患者及其父母(核心家系)为研究对象，进行全基因组cnv扫描，并根据相应的标准对扫描数据进行筛选及致病cnv分析。

1、采用acgh技术进行全基因组cnv扫描

样品准备:抽取患者静脉外周血6-8ml，采用qiagen公司试剂盒提取基因组dna，于-20℃保存备用。取2.0μl已提取的基因组dna，稀释100倍后于分光光度计测量dna浓度，读取数值，计算基因组dan浓度和dna含量；同时读取od260/od280比值，当1.8<od260/od280<2.0为合格。dna浓度不低于40ng/μl，且含量不低于0.5μg的样品方可进行acgh检测分析。

acgh检测，具体步骤如下：

(1)酶切：患者及父母的dna样品选择alui和rsai酶进行酶切反应(37℃2h—65℃20min—12℃8min)；

(2)电泳检测：酶切后的产物应在200bp到500bp之间；

(3)荧光标记：分别用cy3(红色荧光)和cy5(绿色荧光)标记酶切后的dna片段；

(4)纯化：将荧光标记的dna样本过柱纯化；

(5)预杂交：将纯化后带有荧光标记的dna样本混合，在37℃下进行预杂交反应；

(6)杂交反应：将洗好的芯片与探针面紧密结合，放入杂交炉中杂交40h以上；

(7)洗芯片：用bufferi、bufferii充分洗涤芯片；

(8)扫描仪扫描：使用agilent公司提供的扫描仪进行荧光信号强度扫描。

2、ctm全基因组cnv数据筛选及致病基因分析

(1)针对所有发现的cnv，首先将其与基因组变异数据库(databaseofgenomicvariants，dgv)、人类结构变异组数据库(thehumanstructuralvariationproject)等进行比对，判断其是否为罕见cnv或常见cnv；

(2)通过查询数据库decipher，pubmed数据库和omim数据库分析cnvs的致病性。

(3)在pubmed数据中，进行文献检索，比对分析以确认本研究所发现的cnv在既往研究中是否有报道，根据已知相关基因及其信号通路进行更有效的cnv筛选；

(4)按照“患者共享，非患者不携带”的原则，进行位点筛选，尽量在所有患病个体的突变集合中取交集。最后进行突变危害程度的预测，以找到候选的致病cnv突变。

发明人将8例患者的cnv结果与基因组变异数据库(databaseofgenomicvariants，dgv)、decipher、pubmed数据库和omim数据库进行比较分析，发现其中2例患者存在相同染色体dna拷贝数的缺失即17p11.2区间发生约有3.7mb的缺失，分别位于17号染色体的chr17:16657364-20374018和16673072-20374018区间，最终认为共同chr17:16673072-20374018区间缺失可能与先天性气管软化疾病发生相关。

实施例3实时定量pcr(real-timepcr)鉴定染色体拷贝数量

1、引物设计

通过对acgh检测结果分析，发明人得到了1个与先天性气管软化相关的cnv区间即chr17:16673072-20374018，进一步通过real-timepcr方法进行验证。

在ucsc数据库查询染色体缺失区间及其所包含的基因。选取上述cnv区间内的关键基因aldh3a1、atpaf2，并利用ensembel网站查询基因组序列。利用primer5.0设计实时荧光定量pcr引物，分别设计两段引物使其平均分布于关键aldh3a1、atpaf2基因，共4对引物。引物要求其gc含量40％-60％之间；退火温度55℃-65℃之间；产物长度控制在80bp到250bp。引物序列，目的片段长度，及其退火温度如下：

表1引物序列

2、实时荧光定量pcr

本研究利用美国abi公司生产的abistepone定量pcr仪实行greeni嵌合荧光法real-timepcr。

real-time反应体系(20μl)：以acgh检测中发现的2例17p11.2区间缺失患者的基因组dna为病理样本，选取一名扩增良好的正常对照作为参照样本，分别对患者进行特异性引物实时荧光定量pcr，其中选取通用引物gapdh作为内参进行定标。real-timepcr采用日本takara公司green试剂盒进行扩增，反应体系如下：

表2反应体系

real-timepcr反应条件：

预变性94℃变性30s后，开始扩增循环：94℃变性5s，60℃退火34s，72℃延长20s，共循环45次。绘制溶解曲线：95℃15s，60℃1min，95℃15s。通过绘制扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于qpcr分析。根据绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，说明本研究引物特异性良好，扩增产物单一。

3、real-time相对定量分析：

利用相对定量分析法对2例患者特异性引物拷贝数与正常人特异性引物拷贝数进行定量分析，分别以通用引物gapdh为内参照点。将正常人特异性引物及通用引物扩增的相对定量值relativequantification(rq)设为1，将2例患者特异性引物和通用引物扩增与正常对照组进行比较得到rq值(实验重复3次，计算平均值)，并以此rq为纵坐标作图，结果图1所示。

通过定量分析可以得出17号染色体chr17:16673072-20374018p区域的关键基因的特异性引物相对量与正常对照组相比，其比值小于0.5。该结果表明此区域的关键基因拷贝数减少，这也反应了该区域的拷贝数目减少，与acgh检测结果相一致。

实施例4致病cnv在小样本ctm患者人群水平验证

采用荧光实时定量pcr的方法在20例散发ctm患者及8例正常对照的小样本中对chr17:16673072-20374018区间缺失进行验证。

pcr扩增在abistepone平台上完成，采用greeni嵌合荧光法，以gapdh为内参序列，利用方法计算相对拷贝数，比较患者及对照致病cnv拷贝数的差异，以评估致病cnv与疾病的相关性。其中，pcr反应体系和反应条件以及反应引物照实施例3所述步骤进行。

结果显示，在20例散发ctm患者中发现3例患者致病cnv拷贝数减少，进一步说明，17号染色体chr17:16673072-20374018区间缺失与先天性气管软化疾病的相关，可以作为进一步研究先天性气管软化疾病治疗和诊断的分子靶点。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>首都医科大学附属北京儿童医院

<120>一种与先天性气管软化相关的cnv片段及其应用

<130>p18051

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>3

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<212>dna

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