一株新型鞘氨醇盒菌菌株及其在微囊藻毒素降解解毒领域的应用的制作方法

本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一株新型鞘氨醇盒菌菌株及其在微囊藻毒素降解解毒领域的应用。

背景技术：

近年来随着人类生活方式的改变，城镇工业的迅速发展和城市人口的增加，大量的生活污水和工业废水注入湖泊，致使湖泊渐渐富营养化。水体环境富营养化引起的蓝藻水华问题在我国已日趋严重，淡水湖泊如滇池、太湖和巢湖，每年夏秋季都会爆发高浓度的蓝藻水华，蓝藻水华经常会产生次级代谢产物微囊藻毒素，对水体生态系统和人类健康带来严重的危害。

微囊藻毒素(microcystins，mcs)是由淡水蓝藻中的微囊藻、颤藻及念珠藻等几类主要的淡水蓝藻产生的最常见的毒素。微囊藻毒素是一类具生物活性的环状七肽，一般结构为：环d-丙氨酸-l-x-赤-β-甲基-d-异天冬氨酸-l-z-adda-d-异谷氨酸-n-甲基脱氢丙氨酸，至今已发现100余种的微囊藻毒素异构体。微囊藻毒素主要抑制两种蛋白磷酸酶(pp-1和pp-2a)的活性，造成细胞一系列生理生化反应紊乱，从而引发细胞凋亡或者坏死，进而导致肝组织出血或者坏死，并引发肝炎并促发肝癌，对哺乳动物具有极大的威胁。巴西某医院由于肾透析用水受到了微囊藻毒素的污染，结果导致116人中毒、52人死亡，在国际上引起了巨大震惊。目前，世界卫生组织who规定饮用水mc-lr(分布最广、危害最重的一种微囊藻毒素)限量标准为1μg/l，我国卫生部在2001年沿用了此标准，而且于2006年把mcs作为必检的项目之一。由于微囊藻毒素是一类具有生物活性且性质非常稳定的环状七肽化合物，结构中存在着环状结构和间隔双键，耐酸碱，常规水处理工艺的混凝、沉淀、加氯、煮沸很难将其去除。因此，为保障饮用水和水生态系统的安全，避免微囊藻毒素给人类健康带来的巨大威胁，寻找高效安全的去除水体中微囊藻毒素和解除其毒性的技术方法，已成为我国乃至世界亟待解决的环境科学难题。

目前去除水环境中微囊藻毒素的方法主要有物理法、化学法和生物法等。物理法通常只能将水环境中微囊藻毒素转移至其它地方，仍然存在安全隐患，且处理工艺繁琐、费用昂贵；化学法虽然处理微囊藻毒素效果好，但易造成有毒有害物质的环境残留，导致二次污染的发生。生物代谢转化是水环境中微囊藻毒素去除的主要途径之一，水环境中的一些特殊细菌去除微囊藻毒素效率高、成本低、操作方便、不易产生二次污染和利于生态修复等优点，是一种很有应用前景的环境友好型微囊藻毒素去除技术，可作为去除水环境中微囊藻毒素优先考虑的方法，近年来广泛地引起了国内外学者的高度重视，然而大多数微生物降解微囊藻毒素效率比较低，如：恶臭假单胞菌降解微囊藻毒素mc-lr时，速率仅为0.001μg/ml/h(0.5mg/lmc-lr降解率10天后才达到52.6％)。因此，寻找一种微囊藻毒素降解能力更强的新型菌株，尤其同时具有降解和解毒微囊藻毒素功能的新型菌株，对本技术领域来说具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一株微囊藻毒素降解能力更强的新型鞘氨醇盒菌菌株及其在微囊藻毒素降解解毒领域的应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一株新型鞘氨醇盒菌菌株，该鞘氨醇盒菌(sphingopyxissp.)菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其命名为鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno：16341，保藏时间为2018年8月27日，保藏单位的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

鞘氨醇盒菌yf1属于一株具有微囊藻毒素生物降解特性的革兰氏阴性好氧菌，其是从蓝藻水华严重的太湖污泥中分离、纯化获得。其在na培养基平板上，菌落呈黄色，圆形，边缘整齐，表明光滑较湿润，不透明；革兰氏染色呈红色，表明为革兰氏阴性菌；电镜和显微镜下观察，菌体呈长杆型，长度约为1.9-2.3μm，单胞，无鞭毛。

采用两种通用引物对鞘氨醇盒菌yf1的16srrna序列进行扩增，最终得到seqidno.1所示的dna序列。将扩增的16srrna序列与同源性较高的多株鞘氨醇盒菌(sphingopyxis)属的模式菌株构建系统发育树，显示其16srrna序列与模式菌存在良好的聚类关系并且与鞘氨醇盒菌sphingopyxismacrogoltabidaifo15033^t同源性高达(98.33％)。

综合上述鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)的形态学观察、生理生化鉴定及16srrna序列系统发育分析，可以确定该菌株为鞘氨醇盒菌，本发明将其命名为鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)。

基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述的鞘氨醇盒菌菌株在微囊藻毒素降解解毒领域的应用。

上述的应用，优选的，应用的方法具体包括如下步骤：

(1)将鞘氨醇盒菌yf1接种至牛肉膏蛋白胨培养基上进行培养，得到的发酵母种接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到的发酵液离心，去掉上清液后，得到鞘氨醇盒菌yf1菌体；

(2)将步骤(1)后得到的鞘氨醇盒菌yf1菌体用无菌msm无机盐溶液洗涤后，加入至含有微囊藻毒素的水体中进行降解培养。

优选的，步骤(1)中，牛肉膏蛋白胨培养基的成分包括牛肉膏、蛋白胨和nacl，牛肉膏、蛋白胨和nacl的质量比为1:2:1，牛肉膏蛋白胨培养基的ph为7.0-7.2。

优选的，步骤(1)中，发酵培养基的成分包括牛肉膏、蛋白胨、nacl和蒸馏水，牛肉膏、蛋白胨、nacl和蒸馏水的质量比为1:2:1:200，发酵培养基的ph为6.8-7.5。

优选的，步骤(1)中，发酵培养的温度为20℃-40℃，发酵培养的具体操作包括以下步骤：首先将发酵母种接种至含有新鲜发酵培养基的平皿中进行培养24h-48h，然后接种到装有发酵培养基的三角烧瓶中进行摇床培养24h，再将三角烧瓶中的发酵液作为母液加到发酵培养基中进行同期发酵培养2天。

更优选的，摇床培养得到的发酵液与同期发酵培养采用的发酵培养基的体积比为1:5-10。

优选的，步骤(1)中，离心的转速为5000-12000r/min，离心的时间为5min-15min。

优选的，步骤(2)中，msm无机盐溶液的成分包括k2hpo4、kh2po4、nh4no3、mgso4·7h2o、cacl2·2h2o和fecl3·6h2o，k2hpo4、kh2po4、nh4no3、mgso4·7h2o、cacl2·2h2o和fecl3·6h2o的质量比为16:4:5:2:0.25:0.023。

优选的，步骤(2)中，降解培养的温度为20℃-40℃，水体的ph为6-9。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提供的鞘氨醇盒菌菌株为鞘氨醇盒菌yf1，该菌株对微囊藻毒素具有很强的降解解毒作用，能够很好的应用于治理微囊藻毒素污染，也为微囊藻毒素降解领域提供了新的菌株。

2、本发明的应用，采用鞘氨醇盒菌yf1对微囊藻毒素进行降解解毒，平均代谢速率可高达5mg/(l·h)，高于国内外其他所有已报道的微囊藻毒素降解菌的降解速率，而且鞘氨醇盒菌yf1不仅可以彻底降解微囊藻毒素，还能够解除微囊藻毒素及其降解产物中的毒性，解决了目前菌种不能彻底解除微囊藻毒性的问题，具有较强的实用价值和推广应用价值。

一株鞘氨醇盒菌菌株，该鞘氨醇盒菌(sphingopyxissp.)菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其命名为鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno：16341，保藏时间为2018年8月27日，保藏单位的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例中鞘氨醇盒菌yf1的电镜图。

图2是实施例中鞘氨醇盒菌yf1的革兰氏染色图。

图3是实施例中鞘氨醇盒菌yf1的16srrna序列构建的系统发育树图。

图4是实施例中鞘氨醇盒菌yf1的极性脂组分图。

图5是实施例中鞘氨醇盒菌yf1对微囊藻毒素mc-lr的降解效果图。

图6是实施例中鞘氨醇盒菌yf1对微囊藻毒素mc-lr的降解过程液相色谱图。

图7是实施例中微囊藻毒素mc-lr对蛋白磷酸酶pp2a活性的影响图(*p<0.05)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

本发明提供的一株鞘氨醇盒菌菌株，其命名为鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称cgmcc)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno：16341，保藏时间为2018年8月27日，保藏单位的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

1、菌株的筛选

(1)样品采集

从富营养化严重的太湖采集5g污泥，装入采样瓶后取回，放入4℃冰箱保存备用。

(2)培养基配制

牛肉膏蛋白胨培养基(g/l)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，ph7.0-7.2。

msm无机盐培养基(g/l)：k2hpo41.6g，kh2po40.4g，nh4no30.5g，mgso4·7h2o0.2g，cacl2·2h2o0.025g，fecl3·6h2o0.0023g，ph7.0，121℃灭菌20min；

(3)富集驯化

称取5mg太湖蓝藻堆积池中泥样，悬浮于45ml无菌太湖水中，在(30℃，120rpm)下恒温震荡30min。静置15min，将5ml上清液接种到含有mc-lr的45mlmsm培养基中。

(4)筛选、平板分离

将含微囊藻毒素的msm无机盐培养基富集驯化培养的的菌液，通过梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8)，分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30℃条件下培养48h后，分别挑取不同的单菌落，采用平板划线法于牛肉膏蛋白胨固体培养基上再次进行平板分离，置于30℃培养48h，重复3～4次，得到降解微囊藻毒素的菌株，并将筛选分离获得的单菌株于斜面培养基中保存备用。

2、菌株的鉴定

本发明对实施例提供的菌株进行了鉴定，该鉴定包括以下内容：

(1)形态学鉴定

将本发明实施例提供的菌株划线到牛肉膏蛋白胨培养基固体培养基平板上，然后将平板倒转，在温度为30℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况。平板显示，该菌落小，呈圆形，黄色，菌落不透明，表面较湿润，边缘整齐。如图1所示，显微镜观察细胞呈长杆型，长度约为1.9-2.3μm，单胞，无鞭毛。如图2所示，革兰氏染色为阴性。

(2)生理生化鉴定

使用vitek2compact全自动微生物鉴定系统并选用gn革兰阴性菌鉴定卡对鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)的生理生化特征进行鉴定。结果显示鞘氨醇盒菌yf1

(sphingopyxissp.yf1)尿素酶实验阳性，β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶实验阴性。d-纤维二糖、d-葡萄糖、d-甘露醇、l-苹果酸盐、d-麦芽糖、n-乙酰氨基葡萄糖、β-木糖苷酶、d-甘露糖、d-海藻糖等实验阴性。具体检测结果见表1。

表1鞘氨醇盒菌yf1的vitek2检测结果

(3)菌株的16srrna序列扩增与鉴定

本发明实施例采用天根基因组提取试剂盒提取本菌株中的dna。其中，上述提取试剂盒包括50μl的pcr反应体系，而pcr反应体系包括25μl的2×mastermix；2μl的上游引物(5′-agagtttgatcmtggctcag-3′)；2μl的下游引物(5′-tacggytaccttgttacgaactt-3′)；20μl的ddh2o；1μl的模板dna。pcr反应条件为：在温度为94℃预变性5min；94℃变性0.5min；53℃退火0.5min；72℃延伸1min；30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。pcr产物结果由上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果如序列表seqidno.1所示。

将该扩增出的16srrna序列在ezbiocloud数据库与所有标准菌株16srrna序列进行同源性分析，结果显示同源性较高的序列均属于鞘氨醇盒菌属，选取前18条同源性较高序列并以novosphingobiumclariflavum164^t(ku530129)作为外源参照与本实施例得到的菌株进行系统发育分析。采用mega6.0软件对20株菌运用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，如图3所示，结果显示本实施例得到的菌株明显属于鞘氨醇盒菌(sphingopyxis)属，其16srrna序列与鞘氨醇盒菌sphingopyxismacrogoltabidaifo15033^t(d13720)的同源性高达98.33％。

(4)脂肪酸、细胞醌和极性脂成分分析

使用美国midi(microbialidentification)公司sherolock全自动细菌鉴定系统对本实施例得到的菌株进行脂肪酸成分分析，经检测，本实施例得到的菌株的细胞脂肪酸成分为：w7c-十八碳单不饱和脂肪酸占38.99％，w7c-十六碳单不饱和脂肪酸/w6c-十六碳单不饱和脂肪酸占31.01％，十六碳饱和脂肪酸占13.77％，2-羟基十四碳饱和脂肪酸占4.78％，2-羟基十六碳饱和脂肪酸占3.20％，11-甲基w7c-十八碳单不饱和脂肪酸占2.59％，w8c-十七碳单不饱和脂肪酸占1.60％，w5c-十六碳单不饱和脂肪酸占1.45％。

使用反相高效液相色谱分析法，用十八烷基硅烷色谱柱(ods5mm，150×4.6mm)分析本实施例得到的菌株的细胞醌组分，结果显示细胞醌主要类型为coq-10(98.78％)。通过薄板双向层析方法(tlc)分析鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)极性脂组成，如图4所示，结果显示该菌极性脂包括二磷脂酰甘油(dpg)、磷脂酰甘油(pg)、卵磷脂(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰甲基乙醇胺(pme)、神经鞘糖脂(sgl)、一个未知的糖脂(gl)和两个未知的磷脂(l1、l2)。

上述结果显示，本实施例得到的菌株所包含的脂肪酸与鞘氨醇盒菌属脂肪酸成分占比相近，与多株鞘氨醇盒菌比较，细胞脂肪酸均以w7c-十八碳单不饱和脂肪酸(26.5％-46.6％)、w7c-十六碳单不饱和脂肪酸/w6c-十六碳单不饱和脂肪酸(18.0％-41.8％)为主，且所有鞘氨醇盒菌属呼吸醌均以泛醌coq-10为主要呼吸醌，极性脂中神经鞘糖脂(sgl)为鞘脂单胞菌科特菌特有，尤其鞘氨醇盒菌属细菌所特有。

综合形态学特征、系统发育分析以及化学分类特征，可以将本实施例得到的菌株鉴定为一株鞘氨醇盒菌菌株，其被命名为鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)。并且该菌脂肪酸、细胞醌和极性脂具体的构成比与鞘氨醇盒菌属其他菌株存在较大差异，如鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)与s.macrogoltabidaifo15033^t在形态学特征、生理以及化学分类特征方面存在明显的差异，s.macrogoltabidaifo15033^t存在鞭毛，菌落呈白色或褐色，且与鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)生理生化特征相反，s.macrogoltabidaifo15033^t尿素酶阴性，d-葡萄糖、d-麦芽糖、海藻糖实验均为阳性。细胞化学成分上，s.macrogoltabidaifo15033t的主要脂肪酸包括w7c-十八碳单不饱和脂肪酸和十六碳饱和脂肪酸(12.8％)比例低于鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)。综上分子生物学、形态学、生理以及化学分类特征，可知菌株yf1属于鞘氨醇盒菌属，但为新的种和菌株。经研究，鞘氨醇盒菌yf1对微囊藻毒素具有很强的降解作用，能够很好的应用于治理微囊藻毒素污染，也为微囊藻毒素降解领域提供了新的菌株。

3.鞘氨醇盒菌yf1在微囊藻毒素降解解毒领域的应用

(1)母种配制：将上述得到的鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)接种于牛肉膏蛋白胨培养基上进行培养，并将此菌株作为发酵母种菌株使用；

(2)发酵培养生产：接种发酵母种于发酵培养基中进行发酵培养，得到的发酵液在12000r/min下离心15min，去掉上清液，得到大量鞘氨醇盒菌yf1菌体；

发酵条件是：通气培养，发酵温度为30℃；发酵培养基为液体培养基，发酵培养基配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，蒸馏水1000ml，ph6.8-7.5；

发酵培养的过程分为三个阶段，逐步扩大培养，首先将发酵母种菌株接种于含有新鲜发酵培养基的平皿中(一级培养，24h-48h)，然后接种到装有250ml发酵培养基的三角烧瓶中进行摇床培养(二级培养，约24h)，再将三角烧瓶中的发酵液作为母液加到1.8l的发酵培养基中，进行同期发酵培养(生产性发酵培养，约2天)；二级培养与生产型发酵培养之间母液与发酵培养基之间的体积比为1:10；

(3)降解解毒微囊藻毒素：将离心收集后得到的鞘氨醇盒菌yf1菌体用无菌msm无机盐溶液洗涤两次，重悬于含有5ug/ml微囊藻毒素mc-lr的msm培养基中，并在温度＝30℃，ph＝7，120rpm条件下振荡培养；无菌msm无机盐溶液的配方如下(g/l)：k2hpo41.6g，kh2po40.4g，nh4no30.5g，mgso4·7h2o0.2g，cacl2·2h2o0.025g，fecl3·6h2o0.0023g。

降解实验中，间隔15min取100μl样品并离心，使用hplc测定样品中mc-lr浓度。实验设立三个平行对照组，以无微囊藻毒素降解菌菌群的样品作为对照组。采用配备zorbaxextendc18色谱柱(4.6×150mm，5μm，agilent，usa)和可变波长检测器(vwd)的agilent1100高效液相色谱仪，波长设为238nm，测定和分析mc-lr和降解产物的浓度。通过配备有电喷雾电离界面(hplc-esi-ms)的超高分辨率ltqorbitrapvelosproetd质谱仪鉴定mc-lr的降解产物。

结果如图5所示，鞘氨醇盒菌yf1将5ug/mlmc-lr在60min内完全降解，平均代谢速率可高达5mg/(l·h)，高于国内外其他所有已报道的微囊藻毒素降解菌的降解速率，具有较强的实用价值和推广应用价值。其产物变化过程如图6所示，由图6可知，鞘氨醇盒菌yf1可将微囊藻毒素mc-lr降解为一些其他的降解产物，并最终将mc-lr及其降解产物彻底降解解毒。

为了进一步证明鞘氨醇盒菌yf1对微囊藻毒素的解毒效果，我们还探讨了mc-lr及其降解产物混合溶液对肝细胞胞内蛋白磷酸酶pp2a活性的抑制效果。采用鞘氨醇盒菌yf1代谢降解10μmol/l微囊藻毒素mc-lr0h、1.5h和3h后，去除菌体后得到的反应溶液对正常肝细胞hl7702进行染毒24h，该反应溶液对pp2a的活性抑制率越高则说明mc-lr及其降解产物混合溶液的毒性越大。结果如图7所示，结果显示0h的反应溶液(即mc-lr未被降解时，无降解产物)，其对肝细胞胞内蛋白磷酸酶pp2a活性抑制率为82.1±1.3％，与空白对照组(溶液中不含mc-lr及其降解产物)对pp2a活性的抑制率相比，有显著性差异(p<0.05)；当mc-lr被鞘氨醇盒菌yf1代谢降解1.5h，mc-lr被降解了80％(溶液中含有2μmmc-lr母体以及adda等降解产物)，该溶液对pp2a活性抑制率为26.5±4.5％，与空白对照组相比，有显著性差异；而当mc-lr被代谢降解3h，mc-lr被完全降解时(溶液中不含mc-lr母体，只含有降解产物)，该溶液对pp2a活性抑制率为3.9±0.3％，与空白对照组相比，无显著性差异。由此可知，本发明的鞘氨醇盒菌yf1可以彻底降解微囊藻毒素，并能够解除微囊藻毒素及其降解产物中的毒性，解决了目前菌种不能彻底解除微囊藻毒性的问题，具有较强的实用价值和推广应用价值。

序列表

<110>中南大学

<120>一株新型鞘氨醇盒菌菌株及其在微囊藻毒素降解解毒领域的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1348

<212>dna

<213>鞘氨醇盒菌yf1(sphingopyxissp.yf1)

<400>1

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