一种防治稻曲病的短小芽孢杆菌的制作方法

本发明涉及水稻稻曲病防治技术领域，特别是涉及一种防治稻曲病的短小芽孢杆菌。

背景技术：

稻曲病(ustilaginoideavirens)是继水稻三大主要病害稻瘟病、纹枯病和条纹叶枯病之后又一主要影响水稻生产的病害。随水稻品种更新的加快、施肥水平的提高、栽培制度的改变，稻曲病渐趋加重，严重时可造成20％～30％的产量损失，对水稻产量有着很大影响。稻曲病菌所产生的毒素对人畜食用稻谷安全及对农田环境的生态安全产生严重隐患，所以稻曲病日益受到重视。稻曲病发生危害的历史短、研究起步晚，特别是在稻曲病的防治方面，报道甚少。但是大量使用化学合成农药对环境的影响十分恶劣，因此水稻上稻曲病的生物防治尤为重要。目前，未见报道有研究者筛选出合适的菌株来对水稻上稻曲病进行生物防治。

技术实现要素：

本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种防治稻曲病的短小芽孢杆菌，可以完全解决上述技术问题。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种防治稻曲病的短小芽孢杆菌，易于培养且防治效果较好；所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)zhqn-6，保藏号为：16565。

另外，本发明的另一个目的是，提供一种防治稻曲病的短小芽孢杆菌的筛选方法，简单易行、操作方便，具体包括以下步骤：

在各地的水稻主产区的水稻田中采取土样，从土样中分离出土壤中存在的微生物菌株，采用三点对峙培养法与稻曲病菌菌株进行对峙实验；

筛选出菌株zhqn-6，拮抗效果较好；

经形态特征和分子生物学鉴定指示该菌名为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)。

进一步地说，所述的三点对峙培养法的具体步骤为：

(1)在培养皿上倒入适宜病原菌生长的培养基；

(2)在培养基的正中央放一个直径为5mm的稻曲病菌菌饼；

(3)在距离中央菌饼相同距离的位置放三个待测菌株zhqn-6的菌饼，使三个菌饼呈一个等边三角形排列；

(4)测量抑菌圈的直径大小。

该短小芽孢杆菌的应用，是利用该短小芽孢杆菌对稻曲病进行生物防治，通过三点对峙培养法，短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)zhqn-6对稻曲病的抑菌圈为31.67mm，生防效果较好。抑菌圈的意义在于，表示生防菌对稻曲病菌的抑制作用，抑菌圈越大则说明生防菌对稻曲病菌的抑制越强，防治效果越好。

上述菌种具有如下特征：

1、形态特征：菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐有规则，表面湿润，光滑，菌落向外凸出生长；其细胞呈短杆状。

2、生理生化特征如下表所示：

为了筛选稻曲病菌的高效生防菌，本发明采用三点对峙培养法，对辽宁省、四川省和内蒙古等地区采集的水稻田土样进行分离和筛选，并对生防菌株进行种类鉴定。旨在获得防治效果较高的生防菌株，为稻曲病生物防治提供依据。

与现有技术相比，本发明的短小芽孢杆菌对水稻稻曲病有较好的防治效果，通过三点对峙培养法试验，结果表明短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)zhqn-6对稻曲病的抑菌圈为31.67mm。

本发明的短小芽孢杆菌菌株属生物制剂，不会对环境和生态造成污染，其有利于水稻的无公害生产。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为稻曲病病菌在psa培养基上生长27天后的菌落大小示意图；

图2为稻曲病菌周围接种了短小芽孢杆菌zhqn-6，在psa培养基上生长了27天后的菌落大小示意图；

图3为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)zhqn-6的形态图；

具体实施方式

实施例1：

一种防治稻曲病的短小芽孢杆菌，短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)zhqn-6，保藏号为：16565。保藏日期为：2018年10月10日，保藏单位：中国科学院微生物研究所。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

该短小芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：

在各地的水稻主产区的水稻田中采取土样，从土样中分离出土壤中存在的微生物菌株，采用三点对峙培养法与稻曲病菌菌株进行对峙实验；

(1)在培养皿上倒入适宜病原菌生长的培养基；

(2)在培养基的正中央放一个直径为5mm的稻曲病菌菌饼；

(3)在距离中央菌饼相同距离的位置放三个待测菌株zhqn-6的菌饼，使三个菌饼呈一个等边三角形排列；

(4)测量抑菌圈的直径大小。

筛选出菌株zhqn-6，拮抗效果较好；

经形态特征和分子生物学鉴定指示该菌名为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)。

该菌种具有如下特征：

a)形态特征：菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐有规则，表面湿润，光滑，菌落向外凸出生长；其细胞呈短杆状(如图3所示)。

b)生理生化特征如下表所示：

以上生理生化特征的检测方法如下：

革兰氏染色

染剂的配制

a.结晶紫的混合液：分别配制甲液和乙液，其中：甲液为结晶紫2.0g，95％的乙醇20ml；乙液为草酸铵0.8g，蒸馏水80ml；将甲液乙液混合，静置48小时后过滤。此染液较稳定，在密闭的棕色瓶中可储存数月。

b.碘液：先用3～5ml蒸馏水溶解碘化钾2.0g，再投入碘片1.0g，待碘完全溶解后，加蒸馏水稀释至300ml。

c.脱色液：(1)95％乙醇，(2)丙酮乙醇溶液：95％乙醇70ml和丙酮30ml。

d.复染液：将2.5％番红o乙醇溶液作为母液，使用时再以1:4体积比加入蒸馏水稀释。

染色步骤

(1)用接种针挑取少许菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水或蒸馏水中，风干固定。

(2)用结晶紫的混合液染1min后，用水洗。

(3)碘液作用1min，水洗，吸干。

(4)用95％乙醇或丙酮乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色(约30s)。

(5)用复染液染2-3min，水洗、风干。

深紫色为革兰氏染色阳性细菌；红色为革兰氏染色阴性细菌。

糖、醇类发酵反应

培养基：芽孢菌培养基(nh4)2hpo41.00g，kcl0.20g，mgso40.20g；酵母膏0.20g，琼脂15.00g，糖或醇10.00g，0.04％的溴甲酚紫15.00ml，蒸馏水1l，调ph7.0～7.2；0.04％的溴甲酚紫溶液是取0.04g溴甲酚紫粉末溶于20ml的无水乙醇中，再加入80ml蒸馏水配制而成。以18～24h的幼龄培养物穿刺接种于上述培养基中，28℃培养7d。如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝(紫)则为阴性。

运动性

半固体琼脂穿刺法

1.培养基

根据有鞭毛的细菌可以在半固体培养基中游动却又不能任意游走的现象，观察细菌生长情况，判定试验菌是否有运动性。使用试验菌能良好生长的培养基，在其中加0.4％的琼脂，一般半固体培养基应是放倒试管不流动，而在手上轻轻敲打时琼脂即破裂为宜。

2.接种与观察

用直针穿刺接种试验菌于半固体培养基内，适温培养。细菌的运动性可用透射光目测。如生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性，为阴性；如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示试验菌株有运动性，为阳性。

淀粉水解反应

培养基：在na培养基中加0.2％可溶性淀粉；卢哥氏碘液：碘1.0g，碘化钾2.0g，蒸馏水300ml；取新鲜斜面培养物点种于上述平板，适温培养。培养2-5天，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液平板呈蓝界色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性；仍是蓝黑色为阴性。

耐盐性反应

选择适宜待测菌生长的液体培养基，依鉴定需要加入不同浓度的nacl(3％、5％、7％、10％、20％)，培养基要十分澄清。以18～24h的幼龄培养物接种于上述培养基中，28℃培养7d。与未接种的对照管对比，观察生长情况。生长为阳性，不生长为阴性。

接触酶反应

将24h培养的斜面菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有10％过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。

纤维素水解反应

培养基：胨水基础培养基：蛋白胨5.00g，nacl5.00g，蒸馏水1l，ph7.0～7.2；将基础培养基分装试管，在培养基中浸泡一条优质滤纸。纸条宽度以易于放入试管为宜。纸条长度约5-7cm。测定好氧菌时，应有部分纸条于培养基液面外，测定厌氧菌时，纸条应全浸泡于培养基中。接种培养基，应有不接种的空白对照。适温培养1-4周观察。能将滤纸条分解成一团纤维或将滤纸条折断或变薄者为阳性，滤纸条无变化者为阴性。

v-p测定反应

培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，nacl5g，蒸馏水1l，ph7.0～7.2；试剂：肌酸0.3％或原粉，naoh40％；接种试验菌于上述培养液中，适温培养2、6天；取培养液和40％氢氧化钠等量相混。加少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。不出现红色则为阴性。

吲哚

培养基：1％胰胨水溶液；调ph7.2～7.6；把新鲜的菌种接种于上述培养基中，于适温培养。试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g，乙醇(95％)760ml，浓hcl160ml；培养1，2，4，7天的培养液，沿管壁缓缓加入3-5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加4-5滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。

硝酸盐还原

培养基：液体na培养基1l，kno31g；试剂：1)格里斯氏试剂：a液，对氨基苯磺酸0.5g，10％的稀醋酸150ml；b液，α-萘胺0.1g，蒸馏水20ml，10％的稀醋酸150ml；2)二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。

将测定菌接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养1，3，5天。每株菌作二个重复，另留两管不接种作对照。

取两支干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒人少许培养1，3，5天的培养液，再各加一滴a液及b液，在对照管中同样加入a液，b液各一滴。

当培养液中滴入a，b液后，溶液如变为粉红色，攻瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加一、二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。

甲基红试验

培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，nacl5g，蒸馏水1l，ph7.0～7.2；试剂：甲基红0.1g，95％乙醇300ml，蒸馏水200ml；接种试验菌于上述培养液中，适温培养2、6天；在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应。

柠檬酸盐

培养基：nacl1g，mgso4·7h2o0.2g，nh4h2po40.5g，柠檬酸钠2g，蒸馏水1l，0.04％酚红液20ml，在斜面上划线接种，适温培养3-7天。培养基为碱性(指示剂蓝色或桃红色)者为阳性，否则为阴性。

硫化氢产生

纸条法

培养基：蛋白胨10g，nacl5g，牛肉膏10g，半胱氨酸0.5g，蒸馏水1l，ph7.0～7.4分装试管，每管液层高度4-5cm，112℃灭菌20～30min。

另外将普通滤纸剪成0.5-1cm宽的纸条，长度根据试管与培养基高度而定。用10％的醋酸铅将纸条浸透，然后用烘箱烘干，放于培养皿中灭菌备用。

用新鲜斜面培养物接种培养基。接种后，用无菌子夹取一条醋酸铅纸条用棉塞塞紧，使悬挂于管中，下端接近培养基表面，不接触液面，适温培养。于接种后3，7，14天观察。纸条变黑色者为阳性，不变者为阴性。

由上表可知，革兰氏染色、葡萄糖、蔗糖、乳糖、耐盐性3％、耐盐性5％、耐盐性7％、果糖、木糖、甘露糖、甘露醇、运动性、吲哚、甲基红试验、柠檬酸盐、接触酶、v-p试验呈阳性，耐盐性10％、耐盐性20％、麦芽糖、纤维素水解、肌醇、山梨醇、硝酸盐还原、淀粉水解、硫化氢产生呈阴性。

利用该短小芽孢杆菌对稻曲病进行生物防治，通过三点对峙培养法，短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)zhqn-6对稻曲病的抑菌圈为31.67mm。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。