一种固定化β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的方法与流程

本发明涉及一种固定化β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

β-葡萄糖苷酶(ec3.2.1.21)又叫β-d-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶。其广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物来源包括原核微生物约氏黄杆菌，真核微生物清酒酵母、黑曲霉等。β-葡萄糖苷酶能水解非还原性β-d-糖苷键，游离β-d-糖苷键和配基。同时β-葡萄糖苷酶也具有转糖苷活性，可以将水解活性释放出的配基或葡萄糖体，以β-1,6糖苷键形式转移到其他糖底物上。

龙胆低聚糖是葡萄糖以β-1,6糖苷键连接而形成的功能性低聚糖，包括龙胆二糖，少量的三糖和四糖。龙胆低聚糖不能被人体所降解，而且低热量，适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用。同时龙胆低聚糖作为功能性低聚糖它可以有效的促进肠内双歧杆菌、乳酸菌属等细菌的增殖，从而达到改善肠内菌群的作用。目前已被广泛的运用于食品行业中。

制取低聚龙胆糖方法较多，早期的研究从龙胆属植物的根、茎中提取，也可以利用还原苦杏仁苯法和酸法水解淀粉后从其副产物中提纯获得，但利用提取法制备龙胆低聚糖受原料的限制，且过程复杂，效率低，难以工业化生产。酶转化法具有反应条件温和、可控制性强、对环境污染小等优点，随着生物酶法制备功能性低聚糖的发展，通过β-葡萄糖苷酶酶转化合成龙胆低聚糖糖浆，再经分离纯化精制获得不同规格的龙胆低聚糖成品。工业上主要通过β-葡萄糖苷酶酶转化合成龙胆低聚糖，即通过游离酶或固定化酶将葡萄糖转化为低聚龙胆糖。相比于游离酶，固定化酶具有重复使用、产物易分离、稳定性高、可控性强等优点。β-葡萄糖苷酶固定化的方法有吸附法、包埋法及共价结合法。吸附法即为选择葡聚糖、琼脂糖等有机高分子作为载体；包埋法是利用海藻酸钠与钙盐形成凝胶来包埋β-葡萄糖苷酶；共价结合法是采用乙酰壳聚糖和戊二醛来固定β-葡萄糖苷酶。目前利用固定化酶将葡萄糖转化为低聚龙胆糖的方法几乎未见报导。只有日本食品化工株式会社实现了龙胆低聚糖工业化生产，国内未见工业化生产的报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种固定化β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖方法，包括如下步骤：1)重组菌高密度发酵制备β-葡萄糖苷酶；2)制备壳聚糖微球；3)将2)中制备所得的壳聚糖微球与戊二醛交联得到壳聚糖载体微球；4)将1)中所得的β-葡萄糖苷酶与3)中所得的壳聚糖载体微球进行吸附交联得到固定化酶；5)将4)中制得的固定化酶应用到龙胆低聚糖的生产中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法采用重组毕赤酵母(p.pastoriskm71/ppic9k–bgl1/ppicza-pdi)为出发菌株，在3.6l发酵罐中发酵制备β-葡萄糖苷酶。

本发明的第二个目的是提供一种应用上述重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶的方法，所述方法包括：(1)分批发酵阶段：将种子液以8％-10％接种量接种于发酵罐中，控制温度28-32℃、初始转速180-200rpm、初始通气量7l/min、溶氧28-32％、ph4.5-5.5；(2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，以恒速流加甘油的方式进行补料培养，控制温度28-30℃、溶氧28-32％、ph4.5-5.5；(3)诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到od600为100-200时，用甲醇流加仪流加甲醇诱导产酶，甲醇浓度控制在0.5-1.5％，控制温度25-30℃、溶氧28-32％、ph4.5-5.5，诱导96-144h。

本发明的第三个目的是提供一种β-葡萄糖苷酶固定化的方法，所述方法包括：1)将一定质量的壳聚糖溶于2.0％的醋酸溶液中，制成壳聚糖胶体溶液；2)用带针头的注射器将1)中所得的胶体溶液以40-60滴/min的速度滴入4mol/l氢氧化钠溶液中，形成大小均一的壳聚糖微球，然后用去离子水洗至中性；3)将2)中制好的壳聚糖微球加入到一定浓度的戊二醛溶液中进行交联，4℃条件下静置2-4h后用去离子洗去多余的戊二醛溶液，即可得到壳聚糖微球载体；4)将权利要求2中所得酶液以300-700u/g壳聚糖微球载体的加酶量与3)所得的壳聚糖载体微球于4℃条件下吸附4-24h，洗去未交联的游离酶。

在本发明的一种实施方式中，将固定化酶应用到龙胆低聚糖的生产中,连续酶转化6次，每次结束后检测龙胆低聚糖的产率。

在本发明的一种实施方式中，酶转化在ph5.0，60℃条件下进行，以20％葡萄糖和40％纤维二糖为底物，加酶量为400u/g纤维二糖，反应48h后终止反应。

本发明的有益效果

(1)对重组菌p.pastoriskm71/ppic9k-bgl1/ppicza-pdi3.6l罐发酵培养条件进行优化，结果表明：当诱导温度28℃，初始诱导菌体浓度od600为150，诱导阶段甲醇浓度为1％时，酶活最高，能达到1452u/ml，是目前报导的trichodermaviridea表达最高水平的23.4倍；

(2)以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，采用吸附交联法对β-葡萄糖苷酶进行固定化。当壳聚糖浓度为3.0％，戊二醛浓度为0.8％，游离酶加量为400u/g微球载体，固定化吸附时间为20h时，固定化酶酶活回收率最高达到65.4％；

(3)固定化酶具有良好的连续转化能力，在最佳的转化条件下连续转化6次，龙胆低聚糖产率仍具有15.2％。显示出该固定化酶具有较好的持续利用性及较高的龙胆低聚糖的生产能力。

附图说明

图1壳聚糖浓度对固定化酶酶活力回收率的影响；

图2戊二醛浓度对固定化酶酶活力回收率的影响；

图3吸附时间对固定化酶酶活力回收率的影响；

图4固定化酶的操作稳定性。

具体实施方式

培养基：

(1)种子培养基为：蛋白胨20g/l，酵母粉5g/l，甘油30g/l，ynb13.4g/l。

(2)发酵培养基为：甘油30g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，caso4·2h2o0.939g/l，koh4.13g/l，k2so418.2g/l，85％h3po426.7ml，ptm微量元素4.32ml/l。

(3)补料培养基为：50％甘油，ptm微量元素5ml/l。

(4)ptm微量元素为：zncl220g/l，feso4·7h2o65g/l，cuso4·5h2o6g/l，mnso4·h2o3g/l，cocl20.5g/l，ki0.08g/l，na2moo3.2h2o0.2g/l，h2so45ml/l，生物素0.2g/l。

β-葡萄糖苷酶酶活力分析：

(1)酶活单位定义

每毫升酶液每分钟水解pnpg产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位。

(2)酶活力测定步骤

反应体系为1.0ml，ph4.5的醋酸缓冲液960μl，加入适度稀释的粗酶液20μl，再加入20μl100mmol/l的pnpg，在60℃恒温水浴中预热10min，用秒表精确计时，10min后立即加入200μl的1mol/l的na2co3溶液终止反应，室温放置5min，于400nm处测光吸收值。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。

酶活回收率的计算公式：固定化酶酶活/加入的游离酶总酶活*100％

龙胆低聚糖的检测方法及产率计算公式：酶转化生成的龙胆低聚糖，以及反应体系中的葡萄糖、纤维二糖都是通过hplc进行检测。hplc的条件为：安捷伦1260hplc色谱仪，示差折光检测器，色谱柱为agilentzorbaxnh2(4.6×250mm)，柱温为35℃；参比池温度为40℃；流动相为75％乙腈；0.8ml·min^-1的流速；进样量为10μl。龙胆低聚糖的产率计算公式：龙胆低聚糖质量/底物葡萄糖的质量*100％。

实施例1：重组毕赤酵母3.6l罐高密度发酵条件优化

以前期构建好的重组菌p.pastoriskm71/ppic9k-bgl1/ppicz-a-pdi作为出发菌株，菌株构建方法见preparationofgentiooligosaccharidesusingtrichodermavirideβ-glucosidase,fwang,foodchemistry》,2018,248:340-345，在3.6l罐上进行放大培养，分别从诱导温度、初始诱导菌体浓度和诱导阶段甲醇浓度三个方面对发酵工艺条件进行优化，以实现trichodermavirideβ-葡萄糖苷酶在重组毕赤酵母中的高效表达。具体优化过程如下：

将种子培养液，按照10％的比例接入发酵培养基，于温度30℃，溶氧30％，ph5.0条件下培养到一定程度，开始诱导培养。

(1)诱导温度：在25℃、28℃、30℃三个诱导温度条件下来考察诱导温度对重组菌发酵产酶的影响。设定初始诱导菌体浓度od600为100，控制发酵培养基中甲醇浓度达到体积分数1％，诱导144h后结束发酵，测定酶活。

(2)初始诱导菌体浓度：当菌体浓度分别达到od600为100、150、200时开始诱导，诱导阶段发酵培养基中甲醇体积浓度维持在1％，28℃诱导144h后结束发酵，测定酶活。

(3)甲醇浓度：在初始菌体浓度od600为150，诱导温度为28℃条件下，分别采用0.5％、1％、1.5％三个不同的甲醇浓度进行诱导144h后结束发酵，测定酶活。

经过优化，结果表明：当诱导温度28℃，初始诱导菌体浓度od600为150，诱导阶段甲醇浓度为1％时，酶活最高，能达到1452u/ml，是目前报导的trichodermaviridea表达最高水平的23.4倍。

实施例2：固定化β-葡萄糖苷酶的制备

具体技术方案如下：

(1)以实验室前期构建的重组毕赤酵母(p.pastoriskm71/ppic9k-bgl1/ppicz-a-pdi)为出发菌株，制备β-葡萄糖苷酶酶液；

(2)将壳聚糖溶于2.0％的醋酸溶液中，使壳聚糖浓度达到1.0-5.0％，制成壳聚糖胶体溶液；

(3)用带针头的注射器将2)中所得的胶体溶液以40-60滴/min的速度滴入4mol/l氢氧化钠溶液中，形成大小均一的壳聚糖微球，然后用去离子水洗至中性；

(4)将洗至中性的壳聚糖微球加入到体积浓度为0.4％-1.2％的戊二醛水溶液中，于4℃交联2h，倾去戊二醛溶液，用去离子水洗去多余的戊二醛。

(5)以300-700u/g壳聚糖微球载体的酶添加量将β-葡萄糖苷酶与步骤(4)所得壳聚糖微球载体于4℃条件下吸附4-24h，洗去未交联的游离酶，即得固定化β-葡萄糖苷酶。

固定化β-葡萄糖苷酶的最优条件：当壳聚糖浓度为3.0％，戊二醛浓度为0.8％，游离酶加量为400u/g微球载体，固定化吸附时间为20h时，固定化酶酶活回收率最高达到65.4％。

实施例3：固定化β-葡萄糖苷酶转化生产龙胆低聚糖

将固定化酶连续酶转化6次，每次结束后检测低聚龙胆糖的产率。具体地，酶转化在ph5.0，60℃条件下进行，以20％葡萄糖和40％纤维二糖为底物，加酶量为400u/g纤维二糖，反应48h后终止反应，将固定化酶从中滤出。检测反应液中龙胆低聚糖的含量，计算龙胆低聚糖的产率，然后，将固定化酶重新投入新鲜的底物中催化反应。结果表明，随着转化次数的增加，低聚龙胆糖的产率(实际产量与理论产量的比值)逐渐下降，连续转化第6次时的龙胆低聚糖产率仍具有15.2％。显示出该固定化酶具有较好的持续利用性及较高的龙胆低聚糖的生产能力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。