一种EGFR抗体及其制备方法和应用与流程
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种egfr抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
人类表皮生长因子受体(egfr，humanepidermalgrowthfactorreceptor，也称为her-1或erb-b1)是一个170kda的跨膜蛋白受体，由原癌基因c-erbb编码，膜内区具有酪氨酸激酶活性(modjtahedietal.，br.j.cancer73:228-235，1996；herbstandshin，cancer94:1593-1611，2002)。egfr全长序列在swissprot数据库的编号为p00533。egfr通过酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节多种细胞生理过程，主要包括细胞增殖及分化、细胞存活及凋亡、血管生成、以及细胞的有丝分裂和细胞转移(atalayetal.，ann.oncology14:1346-1363，2003；tsaoandherbst，signal4:4-9，2003；herbstandshin，cancer94:1593-1611，2002；modjtahedietal.，br.j.cancer73:228-235，1996)。
egfr的配体包括egf，tgfa/tgf-alpha，amphiregulin，epigen/epgn，btc/betacellulin，epiregulin/ereg和hbegf/heparin-bindingegf。受体-配体结合后会触发egfr形成同源或者异源二聚体，从而使胞内区发生自身磷酸化，进一步激活复杂的下游信号级联反应，主要包括下列几条信号通路:ras-raf-mek-erk信号通路，磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)信号通路，plcgamma-pkc信号通路和statsmodules信号通路。
在多种肿瘤中发现了egfr的过度表达，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、和肾癌等(atalayetal.，ann.oncology14:1346-1363，2003；herbstandshin，cancer94:1593-1611，2002；andmodjtahedietal.，br.j.cancer73:228-235，1996)。在很多情况下，egfr的过度表达与患者的不良预后相关。(herbstandshin，cancer94:1593-1611，2002；modjtahedietal.，br.j.cancer73:228-235，1996)。egfr也表达于正常组织中，在皮肤、肝脏和胃肠道的上皮组织中表达量较高，但表达水平远低于肿瘤组织(herbstandshin，cancer94:1593-1611，2002)。
目前市场上已有两个抗表皮生长因子受体的治疗性抗体，一个是人鼠嵌合抗体c225抗体(爱必妥，erbitux或cetuximab，imclone(现在elililly)公司)，与表皮生长因子受体有特异亲和性，可阻断egf和tgfα等配体与表皮生长因子受体的结合，抑制其磷酸化和下游信号传导，从而抑制肿瘤细胞的生长，诱导凋亡，减少基质金属蛋白酶和血管上皮生长因子的产生。2004年美国fda批准爱必妥治疗结直肠癌，2006年批准其治疗头颈部癌，目前有更多临床试验用于其它肿瘤适应症。在临床上，爱必妥和伊立替康合用治疗结直肠癌的有效率(orr)为23％，与氟嘧啶等化疗药物合用治疗头颈癌的有效率为13％-30％。由于是人鼠嵌合抗体，爱必妥在临床试验中有3.7％的病人产生了抗体反应。
另一个抗表皮生长因子受体的治疗性抗体是帕尼单抗(vectibix，panitumumab，amgen公司)，是采用转基因小鼠技术制备的全人化单克隆抗体，无鼠源蛋白序列。该抗体靶向作用于表皮生长因子受体(egfr)，2006年9月被fda批准上市，与氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康合用或在化疗后用于治疗egfr阳性的转移性结直肠癌。2006年fda批准其单药治疗化疗耐受的转移性结直肠癌(mcrc)。然而帕尼单抗是igg2亚型抗体，与igg1相比，igg2的cdc活性及adcc等生物学活性明显减低；另外，igg2亚型抗体稳定性较差，这可能是临床效果上全人抗体帕尼单抗与嵌合抗体爱必妥相比没有明显优势的主要原因。在临床上治疗结直肠癌的总体生存率(or)才达到8％，非进展生存期只延长了3.6个月。
目前大量的临床数据显示爱必妥单抗和帕尼单抗只对egfr表达的kras野生型(kraswildtype)有疗效，而对kras突变体没有肿瘤生长抑制活性，因此，美国临床肿瘤协会发表的指导原则中明确指出抗egfr单抗药物只适用于kras野生型的结肠癌病人(allegracj，jessupjm，somerieldmr，hamiltonsr，hammondeh，hayesdf，etal.americansoceiteyofclinicaloncologyprovisionalclinicalopinion：testingforkrasgenemutationsinpatientswithmetastaticcolorectalcarcinomatopredictresponsetoanti-epidermalgrowthfactormonoclonalantibodytherapy.j.clinoncol.2009；27：2091-2096；bardellia，sienas.molecularmechanismsofresistancetocetuximabandpanitumumabincolorectalcancer.jclinoncol.2010；28：1254-1261)。
因此，本领域亟需具有更高生物学活性的抗表皮生长因子受体的抗体类药物，尤其是对kras突变体有疗效的抗体类药物，例如双特异性抗体药物，抗体偶联药物以及嵌合抗原受体t细胞免疫疗法等以进一步提高疗效。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服目前缺少egfr抗体的缺陷，提供一种亲和力高、特异性强的egfr抗体及其制备方法和应用。所述的egfr抗体，与egfr蛋白具有高度亲和力，对egfr阳性细胞进行细胞毒杀伤作用，因此能够运用于治疗肿瘤等药物的制备中。
本发明采用杂交瘤技术，综合运用多种免疫方法，利用有效的细胞水平功能性实验进行筛选，开发出了一组高亲和力、高生物学活性和高多样性的egfr先导抗体。然后通过分子生物学方法测序获知egfr抗体的重链可变区和egfr抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明通过杂交瘤技术得到的抗体或抗原结合区均含有一条抗体轻链可变区和一条重链可变区，每一可变区均含有cdr1、cdr2、cdr3三个结构域。用于鉴定抗体分子内重链可变区和轻链可变区，及抗体可变区氨基酸序列内的cdr的方法和技术是本领域熟知的，并且可以用于识别在此公开的特定抗体可变区氨基酸序列内的cdr。可用于识别的cdr的边界示例约定包括，例如，kabat定义，chothia定义，和abm定义。概括地说，所述的kabat定义基于序列多样性，所述chothia定义基于结构环区域的位置，abm定义是kabat定义和chothia方法之间的折中。其它公共数据库，也可用于鉴定抗体中的cdr序列。本发明中cdrs的编号依据的是chothia定义。
本发明提供一种egfr抗体，其包括互补决定区(cdr)：重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3中的一种或多种，和/或，egfr抗体的轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3中的一种或多种，其中，所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.2、seqidno.10、seqidno.18、seqidno.26、seqidno.34、seqidno.42、seqidno.50、seqidno.58、seqidno.66、seqidno.74、seqidno.82或seqidno.90所示；所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.3、seqidno.11、seqidno.19、seqidno.27、seqidno.35、seqidno.43、seqidno.51、seqidno.59、seqidno.67、seqidno.75、seqidno.83或seqidno.91所示；所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.4、seqidno.12、seqidno.20、seqidno.28、seqidno.36、seqidno.44、seqidno.52、seqidno.60、seqidno.68、seqidno.76、seqidno.84或seqidno.92所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.6、seqidno.14、seqidno.22、seqidno.30、seqidno.38、seqidno.46、seqidno.54、seqidno.62、seqidno.70、seqidno.78、seqidno.86或seqidno.94所示；所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.7、seqidno.15、seqidno.23、seqidno.31、seqidno.39、seqidno.47、seqidno.55、seqidno.63、seqidno.71、seqidno.79、seqidno.87或seqidno.95所示；所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.8、seqidno.16、seqidno.24、seqidno.32、seqidno.40、seqidno.48、seqidno.56、seqidno.64、seqidno.72、seqidno.80、seqidno.88或seqidno.96所示；
或者，所述重链cdr1的氨基酸序列与如序列表中seqidno.2、seqidno.10、seqidno.18、seqidno.26、seqidno.34、seqidno.42、seqidno.50、seqidno.58、seqidno.66、seqidno.74、seqidno.82、seqidno.90所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链cdr2的氨基酸序列与如序列表中seqidno.3、seqidno.11、seqidno.19、seqidno.27、seqidno.35、seqidno.43、seqidno.51、seqidno.59、seqidno.67、seqidno.75、seqidno.83、seqidno.91所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链cdr3的氨基酸序列与如序列表中seqidno.4、seqidno.12、seqidno.20、seqidno.28、seqidno.36、seqidno.44、seqidno.52、seqidno.60、seqidno.68、seqidno.76、seqidno.84、seqidno.92所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列与如序列表中seqidno.6、seqidno.14、seqidno.22、seqidno.30、seqidno.38、seqidno.46、seqidno.54、seqidno.62、seqidno.70、seqidno.78、seqidno.86、seqidno.94所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链cdr2的氨基酸序列与如序列表中seqidno.7、seqidno.15、seqidno.23、seqidno.31、seqidno.39、seqidno.47、seqidno.55、seqidno.63、seqidno.71、seqidno.79、seqidno.87、seqidno.95所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链cdr3的氨基酸序列与如序列表中seqidno.8、seqidno.16、seqidno.24、seqidno.32、seqidno.40、seqidno.48、seqidno.56、seqidno.64、seqidno.72、seqidno.80、seqidno.88、seqidno.96所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示。
较佳地，所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.2所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.3所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.4所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.10所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.11所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.12所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.18所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.19所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列中表seqidno.20所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.26所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.27所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.28所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.34所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.35所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.36所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.42所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.43所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.44所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.50所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.51所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.52所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.58所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.59所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.60所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.66所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.67所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.68所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.74所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.75所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.76所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.82所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.83所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.84所示；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.90所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.91所示，且所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.92所示；
所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.6所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.7所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.8所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.14所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.15所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.16所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.22所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.23所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.24所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.30所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.31所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.32所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.38所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.39所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.40所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.46所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.47所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.48所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.54所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.55所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.56所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.62所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.63所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.64所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.70所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.71所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.72所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.78所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.79所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.80所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.86所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.87所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.88所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.94所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.95所示，且所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.96所示。
更佳地，所述egfr抗体包括含有所述cdr的egfr抗体重链可变区和/或egfr抗体的轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.1、seqidno.9、seqidno.17、seqidno.25、seqidno.33、seqidno.41、seqidno.49、seqidno.57、seqidno.65、seqidno.73、seqidno.81或seqidno.89所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.5、seqidno.13、seqidno.21、seqidno.29、seqidno.37、seqidno.45、seqidno.53、seqidno.61、seqidno.69、seqidno.77、seqidno.85或seqidno.93所示。
进一步更佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.1所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.5所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.9所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.13所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.17所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.21所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.25所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.29所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.33所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.37所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.41所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.45所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.49所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.53所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.57所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.61所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.65所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.69所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.73所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.77所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.81所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.85所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.89所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno.93所示。
综上，本发明提供了一组与egfr反应的抗体或抗原结合片段：
在一系列的实例中，本发明提供了一组与egfr反应的抗体或抗原结合片段：
一条重链可变区，其氨基酸序列号为1和基因序列号为97，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为2、3、4；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为5和基因序列号为98，包含轻链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为6、7、8；
一条重链可变区氨基酸序列号为9和基因序列号为99，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为10、11、12；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为13和基因序列号为100，包含轻链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为14，15，16；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为17和基因序列号为101，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为18、19、20；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为21和基因序列号为102，包含轻链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为22、23、24；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为25和基因序列号为103，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为26、27、28；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为29和基因序列号为104，包含轻链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为30、31、32。
一条重链可变区，其氨基酸序列号为33和基因序列号为105，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为34、35、36；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为37和基因序列号为106，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为38、39、40；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为41和基因序列号为107，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为42、43、44；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为45和基因序列号为108，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为46、47、48；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为49和基因序列号为109，包含重链cdr1，cdr2cdr3，其氨基酸序列号分别为50、51、52；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为53和基因序列号为110，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为54、54、56；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为57和基因序列号为111，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为58、59、60；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为61和基因序列号为112，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为62、63、64；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为65和基因序列号为113，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为66、67、68；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为69和基因序列号为114，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为70、71、72；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为73和基因序列号为115，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为74、75、76；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为77和基因序列号为116，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为78、79、80；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为81和基因序列号为117，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为82、83、84；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为85和基因序列号为118，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为86、87、88；
一条重链可变区，其氨基酸序列号为89和基因序列号为119，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为90、91、92；
一条轻链可变区，其氨基酸序列号为93和基因序列号为120，包含重链cdr1，cdr2，cdr3，其氨基酸序列号分别为94、95、96。
较佳地，所述的egfr抗体还包括构架区，所述构架区包括重链构架区和/或轻链构架区；较佳地，所述重链构架区为人或鼠抗体重链构架区，和/或，所述轻链构架区为人或鼠抗体轻链构架区；更佳地，所述重链构架区为人抗体重链构架区，且所述轻链构架区为人抗体轻链构架区。
较佳地，所述的egfr抗体还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区优选人源或小鼠源抗体重链恒定区，所述的抗体轻链恒定区优选人源或小鼠源抗体轻链恒定区。
所述的egfr抗体优选egfr的单克隆抗体、抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、单域抗体或单区抗体。
所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为igg1、igg2、igg3或igg4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为fab和f(ab’)。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述egfr抗体的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该egfr抗体的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该egfr抗体的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述egfr抗体并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述egfr抗体。
本发明还提供一种核酸，其编码上述的egfr抗体。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.97、seqidno.99、seqidno.101、seqidno.103、seqidno.105、seqidno.107、seqidno.109、seqidno.111、seqidno.113、seqidno.115、seqidno.117或seqidno.119所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.98、seqidno.100、seqidno.102、seqidno.104、seqidno.106、seqidno.108、seqidno.110、seqidno.112、seqidno.114、seqidno.116、seqidno.118或seqidno.120所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.97所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.98所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.99所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.100所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.101所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.102所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.103所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.104所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.105所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.106所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.107所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.108所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.109所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.110所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.111所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.112所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.113所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.114所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.115所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.116所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.117所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.118所示；或，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.119所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中seqidno.120所示。
本发明还提供一种包含上述的核酸的重组表达载体。其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述的重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为e.colitg1或bl21细胞(表达单链抗体或fab抗体)，或者cho-k1细胞(表达全长igg抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
本发明还提供一种egfr抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得egfr抗体。
本发明还提供一种药物组合物，其包括上述的egfr抗体以及药学上可接受的载体。
所述的药学可接受的载体为本领域常规的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述egfr或者上述免疫偶联物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，即可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更佳地为经由血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地，所述药物组合物还可以作为气雾剂或粗喷雾剂施用，即经鼻施用；或者，鞘内、髓内或心室内施用。更佳地，所述的药物组合物还可以透皮、经皮、局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。
本发明所述的药物组合物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射，或进行调整。所选择的剂量水平和方案依赖于包括所述药物组合物的活性和稳定性(即，半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各种因素而进行合理地调整。
对于本发明的所述药物组合物的治疗有效剂量可以最初在细胞培养实验或动物模型例如啮齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓度范围和途径。随后可以用于确定在人中施用的有用剂量和途径。一般地，施用有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估为本领域技术人员已知。
对于组合疗法，上述egfr抗体、上述免疫偶联物和/或另外的治疗或诊断剂可以各自作为单一药剂，在适合于执行预期治疗或诊断的任何时间范围内进行使用。因此，这些单一药剂可以基本上同时(即作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以按顺序连续施用。例如，这些单一药剂可以在一年内，或10、8、6、4或2个月内，或4、3、2、或1周内，或5、4、3、2或1天内施用。
关于制剂、剂量、施用方案和可测量的治疗结果的另外指导，参见berkow等人(2000)themerckmanualofmedicalinformation(merck医学信息手册)和merck&co.inc.,whitehousestation,newjersey；ebadi(1998)crcdeskreferenceofclinicalpharmacology(临床药理学手册)等著作。
本发明还提供一种上述egfr抗体或者上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供一种检测过表达egfr蛋白的细胞的方法，所述方法包括如下的步骤：将上述egfr抗体与待检样品在体外接触，检测所述的egfr抗体与所述待检样品的结合即可。
本发明还提供一种检测过表达egfr蛋白的细胞的组合物，所述组合物包括上述egfr抗体作为活性成分。
本发明还提供一种上述egfr抗体、或者上述药物组合物在制备预防或治疗与egfr表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用；较佳地，所述的与egfr表达或功能异常相关的疾病为肿瘤，所述肿瘤优选膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或者肾癌。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
所述的egfr抗体，与egfr蛋白具有高度亲和力，经elisa检测，可以与人egfr蛋白和食蟹猴egfr蛋白结合，与小鼠egfr蛋白不结合；经facs检测，可以识别肿瘤组织中的人egfr蛋白。另外，对egfr阳性细胞进行细胞毒杀伤作用，因此能够运用于治疗肿瘤等药物的制备中。
附图说明
图1为人egfr蛋白转染的cho-k1细胞facs筛选检测结果。
图2为人egfr蛋白转染的293f细胞facs筛选检测结果。
图3a和3b为elisa检测egfr蛋白免疫后小鼠血清抗体效价情况。
图4为facs检测egfr抗体与a431的结合反应。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
治疗用单克隆抗体可由多种技术和途径进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等。但是通过杂交瘤技术制备单抗，仍然是目前治疗用单抗制备方法的主流。本发明根据目前最新的单抗技术进展，采用优化的杂交瘤技术，来制备所需的抗egfr抗体。
传统的杂交瘤制备技术由kohlerandmilstein在40年前建立(kohlerandmilstein1975，nature256:495)，现在已广泛应用于科研、诊断、治疗等许多相关的单克隆抗体的制备和生产之中。其基本方法虽然延用至今，但在许多方面都有所变化、改进和创新，包括不同品系动物如转基因动物的使用、电融合技术的引入、高效筛选技术设备的应用如clonepix设备等，使杂交瘤技术的应用更多样化和更加高效。从常规动物如小鼠等制备的单抗，可以通过常规分子生物学方法克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因，可变区基因可以嫁接到人源抗体恒定区基因从而形成人鼠嵌合抗体(u.s.pat.no.4,816,567，cabillyetal),以大大降低人体使用时的免疫原性。更进一步，鼠源抗体可变区的cdr结构域可以嫁接到人源抗体架构上，从而使鼠源抗体成分降低到5％以下，大大增加了抗体在人体内使用的安全性。这一途径得到抗体称为人源化抗体，并且是目前抗体药物市场的主要产品(u.s.pat.no.5,225,539to55,winter,andu.s.pat.nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762and6,180,370toqueenetal。
本发明利用单克隆抗体技术，综合运用多种免疫方法，利用有效的细胞水平功能性实验开发出了一组高亲和力、高生物学活性和高多样性的egfr先导抗体。这些抗体显示出优异的性质，能够与人egfr的胞外区相结合。然后通过分子生物学方法测序获知egfr抗体的重链可变区和egfr抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
实施例1egfr抗体的制备
(一)、免疫原a的制备
将含有编码人源egfr蛋白胞外区氨基酸序列(ncbi：np_005219.2)的核苷酸序列克隆到带有人iggfc片段(hfc)的pcpc载体(购自invitrogen，v044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见sambrook,j.,fritsch,e.f.,andmaniatis,t.(1989).molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition(plainview,newyork:coldspringharborlaboratorypress)。对hek293细胞(购自invitrogen)进行瞬时转染(pei，polysciences)并使用freestyletm293(invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含egfr蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白a亲和层析柱(mabselectsure，购自gehealthcare)，同时用紫外(uv)检测仪监测紫外吸收值(a280nm)的变化。上样后用pbs磷酸盐缓冲液(ph7.2)清洗蛋白a亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1m甘氨酸盐酸(ph2.5)洗脱，收集从蛋白a亲和层析柱上洗脱下来的带hfc标签的egfr蛋白(egfr-hfc)，用pbs磷酸盐缓冲液(ph7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原a。
(二)、免疫原b的制备
编码人源egfr全长氨基酸序列(ncbi：np_005219.2)的核苷酸序列被克隆到pires载体(购自clontech)并制备质粒。对hek293细胞系和cho-k1细胞系(均购自invitrogen)进行质粒转染(pei，购自polysciences)后，在含0.5μg/ml的含10％(w/w)胎牛血清的dmem培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)co2培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的egfr抗体(购自absoluteantibody，#ab00184-1.1)经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原b。具体选择结果如表1和图1所示，igg亚型对照为小鼠igg对照。表1,2说明，已经制得egfr阳性表达的cho-k1细胞系，以及egfr阳性表达的hek293f细胞系。图1中，横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。图1的结果说明，cho-k1-hegfr3g2为egfr高水平表达细胞株。
表1人源egfr蛋白的cho-k1稳转细胞系facs检测结果
(三)、杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
a、免疫原a免疫采用6～8周龄balb/canncrl小鼠或sjl/jorllcocrl小鼠(购自上海斯莱克公司)，小鼠在spf条件下饲养。初次免疫时，免疫原a蛋白用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原a蛋白。加强免疫时，免疫原a蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原a蛋白。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用elisa和facs检测血清中免疫原a的抗体效价和特异性，结果如图3和表2、3所示。表2、3说明，经人源egfr-hfc免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在一百万左右。其中空白对照为1％(w/w)bsa，其中批次指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为od450nm值。
表2elisa检测egfr蛋白免疫后balb/c小鼠血清抗体效价
表3elisa检测egfr蛋白免疫后sjl小鼠血清抗体效价
b、免疫原b免疫采用6～8周龄balb/canncrl小鼠或sjl/jorllcocrl小鼠(购自上海斯莱克公司)，小鼠在spf条件下饲养。含有编码人源egfr全长氨基酸序列的核苷酸序列的pires质粒[参见实施例1步骤(二)]转染hek293细胞系，得含有人源egfr的hek293稳定细胞系(转染使用x-tremegenehpdnatransfectionreagent，购自roche公司，货号cat#06366236001，并按说明书操作)在t-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用dmem基础培养基(购自invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(购自invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落，收集细胞。用dmem基础培养基洗涤2次，进行细胞计数后将细胞用磷酸盐缓冲液(ph7.2)稀释至2╳107细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周，以后每次免疫间隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用facs检测血清中抗体效价和特异性。在第二次加强免疫后，facs检测血清抗体效价达到1:1000以上。
a～b步骤完成前，将所选择的每只小鼠最后一次免疫腹腔注射100微克纯化的免疫原a(原a进行免疫反应的小鼠)或免疫原b针对免疫原b进行免疫反应的小鼠)，5天后处死小鼠，收集脾细胞。加入nh4oh至终浓度1％(w/w)，裂解脾细胞中掺杂的红细胞，获得脾细胞悬液。用dmem基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按照活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(购自atcc)混合，采用高效电融合方法(参见methodsinenzymology,vol.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1╳hat的dmem培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按1╳105/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％co2、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后用elisa和acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清，将elisa中od450nm>1.0和acumen中mfi值>100的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(w/w)ht胎牛血清，dmem(invitrogen)在37℃，5％(v/v)co2条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析，用elisa、facs确定对egfr蛋白和egfr阳性细胞的结合活性(结合活性的检测方法请分别参见实施例3a和实施例3b)，以及抗小鼠抗体-mmaf间接细胞毒杀伤实验(间接细胞毒杀伤活性检测方法请分别参见实施例4)。
根据24孔板筛选结果，挑选elisa实验中od450nm>1.0、facs实验中mfi值>50和间接细胞毒杀伤实验中杂交瘤细胞培养上清对egfr阳性细胞杀伤率达到50％的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆，选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10％(w/w)fbs的dmem培养基中(购自invitrogen)37℃，5％(v/v)co2条件下培养。亚克隆后10天用elisa和acumen进行初步筛选，挑选单个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用facs确定抗原结合阳性并用抗小鼠抗体-mmaf间接细胞毒杀伤实验评估生物活性(评估标准为elisa实验中od450nm>1.0、facs实验中mfi值>50和间接细胞毒杀伤实验中杂交瘤细胞培养上清对egfr阳性细胞杀伤率达到50％)。
根据24孔板样品检测结果，挑选出最优的克隆，并于含10％(w/w)fbs的dmem培养基中(购自invitrogen)在37℃，5％(v/v)co2条件下将该最优的克隆进行扩大培养，液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产和纯化。
实施例2先导抗体的生产和纯化
杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅1-10μg/毫升，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1-5毫克)抗体生产纯化。
将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到t-75细胞培养瓶并用生产培养基(hybridomaserumfreemedium，购自invitrogen公司)驯化传代3代。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入200毫升生产培养基，接种细胞密度为1.0╳105/毫升。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，转速3转/分钟。连续旋转培养14天后，收集细胞培养液，过滤去除细胞，并用0.45微米的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进行纯化或-30℃冻存。
澄清的杂交瘤细胞的培养上清液(200ml)中的单克隆抗体用2ml蛋白a柱(购自gehealthcare)纯化。蛋白g柱先用平衡缓冲液(pbs磷酸缓冲液，ph7.4)平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白a柱，控制流速在3ml/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白g柱，平衡缓冲液的体积为4倍蛋白a柱柱床体积。用洗脱液(0.1m柠檬酸钠缓冲液，ph3.5)洗脱结合在蛋白a柱上的egfr抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(a280紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％1.0mtris-hcl缓冲液中和ph，所述百分比为体积百分比，然后立即用pbs磷酸缓冲液透析过夜，第二天换液1次并继续透析3小时。收集透析后的egfr抗体，用0.22微米的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的egfr抗体。
将纯化的egfr抗体进行蛋白浓度(a280/1.4)、纯度、内毒(lonza试剂盒)等检测分析，结果如表4所示，结果发现，抗体最终产品内毒素浓度在1.0eu/毫克以内。
表4纯化的egfr抗体检测分析
实施例3先导抗体的检定
a、流式细胞实验(facs)检测抗体与egfr表达细胞的结合
将实施例1步骤(二)中所述含有编码人源egfr全长氨基酸序列的核苷酸序列导入cho-k1细胞株得含人egfr的cho-k1稳定细胞株(此处称为cho-k1-hegfr稳定细胞株)，然后在t-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用pbs缓冲液(phosphatebuffersaline)(购自invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(versenesolution:购自lifetechnology公司)处理和收集细胞。用pbs缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用pbs缓冲液稀释至2×106细胞每毫升，加入2％小牛血清封闭液，所述百分比为质量百分比，室温孵育15分钟，然后用pbs缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用facs缓冲液(pbs+2％fbs，所述百分比为质量百分比)悬浮至3×106细胞/ml，按每孔100微升加入到96孔facs反应板中，加入实施例2所得的纯化的egfr抗体待测样品每孔100微升，4℃孵育1小时。用facs缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(alexa488)标记的二抗(购自invitrogen)，4℃孵育1小时。用facs缓冲液离心洗涤3次，加入每孔100微升固定液[4％(v/v)多聚甲醛]悬浮细胞，10分钟后用facs缓冲液离心洗涤2次。用100微升facs缓冲液悬浮细胞，用facs(facscalibur，购自bd公司)检测和分析结果。结果如图4和表5所示，表5说明，待测抗体可结合细胞表面的egfr。其中igg对照为鼠igg，表中的数据为mfi所测细胞群的平均荧光强度值。
表5facs检测egfr抗体与a431(人肿瘤细胞系，购自atcc)的结合反应
实施例4轻重链可变区氨基酸序列测定
总rna分离：将实施例1亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后(即经过实施例3～5的检定和活性测定后)，通过离心搜集5×107个杂交瘤细胞，加入1mltrizol混匀并转移到1.5ml离心管中，室温静置5分钟；加0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清；加入1ml75％乙醇(所述百分比为体积百分比)，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入depc处理过的h2o溶解(55℃水浴促进溶剂10分钟)，即得总rna。
逆转录与pcr：取1μg总rna，配置20μl体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μlpcr体系，包括1μlcdna、每种引物25pmol、1μldna聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmoldntps；设置pcr程序，预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得pcr产物。其中逆转录所用的试剂盒为primescriptrtmastermix，购自takara，货号rr036；pcr所用的试剂盒包括q5超保真酶，购自neb，货号m0492。
克隆与测序：取5μlpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为
表6egfr抗体蛋白序列编号
其中，表6中的数字即为序列表中序列号，如51b12d10的重链蛋白可变区的氨基酸序列为seqidno.1，而51b12d10的重链蛋白可变区中cdr1的氨基酸序列为seqidno.2。
表8egfr抗体基因(dna)序列编号
其中，表8中的数字即为序列表中序列号，如编码51b12d10的重链蛋白可变区的核苷酸序列为seqidno.97。
编码51b12d10的重链蛋白可变区中cdr1的核苷酸序列为序列表seqidno.97中的第76位至第99位；
编码51b12d10的重链蛋白可变区中cdr2的核苷酸序列为序列表seqidno.97中的第157位至第171位；
编码51b12d10的重链蛋白可变区中cdr3的核苷酸序列为序列表seqidno.97中的第295位至第318位；
编码51b12d10的轻链蛋白可变区中cdr1的核苷酸序列为序列表seqidno.98中的第70位至第99位；
编码51b12d10的轻链蛋白可变区中cdr2的核苷酸序列为序列表seqidno.98中的第145位至第165位；
编码51b12d10的轻链蛋白可变区中cdr3的核苷酸序列为序列表seqidno.98中的第262位至第288位；
编码67a6f9的重链蛋白可变区中cdr1的核苷酸序列为序列表seqidno.99中的第76位至第96位；
编码67a6f9的重链蛋白可变区中cdr2的核苷酸序列为序列表seqidno.99中的第154位至第171位；
编码67a6f9的重链蛋白可变区中cdr3的核苷酸序列为序列表seqidno.99中的第295位至第330位；
编码67a6f9的轻链蛋白可变区中cdr1的核苷酸序列为序列表seqidno.100中的第70位至第117位；
编码67a6f9的轻链蛋白可变区中cdr2的核苷酸序列为序列表seqidno.100中的第163位至第183位；
编码67a6f9的轻链蛋白可变区中cdr3的核苷酸序列为序列表seqidno.100中的第280位至第306位；
编码80e11e12的重链蛋白可变区中cdr1的核苷酸序列为序列表seqidno.101中的第76位至第96位；
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