原代肿瘤细胞分离培养方法与流程

本发明涉及细胞分离技术领域，具体涉及一种原代肿瘤细胞分离培养方法。

背景技术：

肿瘤细胞实质就是肿瘤。肿瘤是一种基因病，但并非是遗传的。它是指细胞在致瘤因素作用下，基因发生了改变，失去对其生长的正常调控，导致异常增生。可分为良性和恶性肿瘤两大类。前者生长缓慢，与周围组织界限清楚，不发生转移，对人体健康危害不大。

肿瘤形成的过程包括始发突变、潜伏、促癌和演进。始发突变是指细胞在致癌物的作用下发生了基因突变，但是突变发生后如果没有适当的环境不会发展为肿瘤，此阶段称为潜伏期；促癌是指在促癌剂(刺激细胞增长的因子，如激素)作用下开始增殖的过程，促癌因子的作用是可逆的，如果去除，引起扩增的克隆就会消失；演进是指肿瘤在生长过程中越来越变得具有侵袭力的过程，是不可逆的。肿瘤形成往往涉及许多基因的突变，需要十到数十年的时间，因而恶性肿瘤通常属于老年性疾病。

就目前的临床治疗研究情况而言，如何应用日新月异的生物技术有效地筛选应用抗癌药，预测个体肿瘤对药物的敏感性，从而制定个体化的辅助治疗策略指导临床提高疗效已成为医学界研究的热点。在乳腺癌个体化治疗方面，理想的肿瘤原代细胞药敏体系受到国内外肿瘤界的重视。因为就技术层面而言，原代细胞药敏体系的体外药物的敏感性结果与药物的体内疗效有较好的符合率、有较好的结果重复性且实验结果成功评价率高。

一直以来受限于原代肿瘤细胞体外培养的技术，在对肿瘤细胞进行分散时，不能将选取的样品组织内的肿瘤细胞充分分散；而且，所培养的原代肿瘤细胞的培养周期较长，培养成功率和临床一致率均比较低。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，本发明提供了一种原代肿瘤细胞分离培养方法，用于解决背景技术中所提到的技术问题。

为了达到上述的目的，本发明采用以下的技术方案：

原代肿瘤细胞分离培养方法，包括如下步骤：

s1、将新鲜肿瘤组织置于培养皿中，并向其中加入适量pbs，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用含有抗生素的pbs清洗2-3次；

s2、将癌组织放入新的培养皿中并向其中加入少量的dmem培养基，使用眼科剪将组织剪成碎块，并转入15ml离心管中，用pbs冲洗3-5次，组织块自动下沉后，除去pbs；

s3、将组织块转入培养瓶中并向其中加入5ml复合酶溶液，吹散组织碎块，调节ph至7-8；然后将培养瓶置于恒温摇床上，在温度为37℃的条件下消化处理4-10min后，向其中加入胎牛血清终止消化，制成细胞悬液；

s4、每隔20-30min于显微镜下观察一次，待组织块镜下透光性良好且呈絮状时，转入15ml离心管中离心5min，并弃去上清液；

s5、向s4中盛有细胞悬液的培养瓶中加入含有由患有肿瘤病人体内提取的血清、青霉素和链霉素的培养基重悬沉淀物，并采用差速贴壁的方法取出成纤维细胞；

s6、向培养瓶中缓慢通入co2和o2持续120-150min，然后将培养品移至培养箱中培养30-40min后，弃去贴壁的成纤维细胞，将未贴壁的癌细胞悬液移至另一个洁净的培养瓶中，并移至培养箱中进行再次培养；

s7、定期更换培养基，待原代肿瘤细胞长满后，用胰蛋白酶消化，再经差速贴壁纯化后传代。

更进一步地，所述s1中的肿瘤组织取自乳腺癌组织、肝癌组织或肺癌组织中的一种。

更进一步地，所述s1中抗生素的加入量为pbs质量的4-6％，且抗生素选用青霉素或链霉素中的一种。

更进一步地，所述s2中将癌组织切成0.5-1mm³大小的碎块。

更进一步地，所述s3中复合酶溶液的制备方法为：向浓度为200u/ml的胶原酶溶液中加入质量为其0.2-0.35％的胰蛋白酶和0.3-0.5％的透明质酸酶，超声混合均匀后即得复合酶溶液。

更进一步地，所述s4中的离心速率为1200-1500r/min。

更进一步地，所述s5中的培养基的制备方法为：向dmem培养基中加入质量为其10-15％的由患有肿瘤病人体内提取的血清，5-8％的青霉素和3-7％的链霉素，混合均匀后即得培养基成品。

更进一步地，所述s6中co2通入的速率为60-90ml/min，o2通入的速率为40-00ml/min。

采用上述的技术方案，本发明达到的有益效果是：

本发明采用复合酶溶液对癌组织进行分解，其中复合酶溶液中的胶原酶、胰蛋白酶和透明质酸酶这三者之间相互协同，能加速细胞间的桥连结构松动，使癌组织由块状变成絮状，从而细胞团块内的细胞均匀分散在细胞悬液中，增大悬浮在细胞液中的细胞群团和单个细胞的数量。接种培养后，细胞容易贴壁生长，从而提高了细胞的成活率。而且，在培养癌细胞时，通过向培养瓶中通入co2和o2，能将单个细胞或者细胞团充分分散。再者，培养基中加入由患有肿瘤病人体内提取的血清，从而为癌细胞提供最适合其生长的微环境，不仅缩短了培养的周期(约2-3周)，而且培养成功率在80％以上，临床一致率在95％以上，样本需求量也较少，可测药物多，适用于靶向药物和化疗药物，不仅适用于常见实体瘤，同样适用于转移病灶、中低分化瘤，神经内分泌瘤等。另外，经过试验得知he染色显示病理形态跟肿瘤组织切片中的基本无差异，免疫组化染色显示蛋白表达、分子分型等于肿瘤组织切片中的基本无差异。

附图说明

图1为胸水中分离得到的原代细胞；其中：

a为明亮视野下观察到的肺癌原代细胞；

b为he染色后观察到的肺癌原代细胞；

图2为经过五天培养形成肿瘤细胞团；其中：

c为经过五天培养形成的肺癌原代细胞；

d为经过五天培养形成的肺肿瘤细胞团；

图3为使用阿帕替尼作为体外药敏试验的药品时所得的原代肺肿瘤细胞图像；

图4为使用舒尼替尼作为体外药敏试验的药品时所得的原代肿瘤细胞图像；

图5为使用紫杉醇和顺铂配合使用作为体外药敏试验的药品时所得的原代肿瘤细胞图像；

图6为使用拉帕替尼作为体外药敏试验的药品时所得的原代肿瘤细胞图像；

图7为穿刺患有her2阳性乳腺癌iii期的女性患者乳腺癌细胞后培养七天后所得的原代肿瘤细胞；

图8为使用多西他赛和氟脲嘧定配合使用作为体外药敏试验的药品时所得的原代乳腺肿瘤细胞图像；

图9为使用表柔比星作为体外药敏试验的药品时所得的原代乳腺癌细胞图像；

图10为使用卡铂和长春瑞滨配合使用作为体外药敏试验的药品时所得的原代乳腺癌细胞图像；

图11为使用曲妥珠单抗作为体外药敏试验的药品时所得的原代乳腺癌细胞图像。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

在取得病人知情同意后，于北京某肿瘤医院取得肺癌手术患者的肿瘤样本和正常样本，且患者性别为男性，年龄为85岁，临床诊断为肺癌iv期。

s1、将新鲜肺癌肿瘤组织置于培养皿中，并向其中加入适量pbs，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肺癌肿瘤细胞丰富的区域，并用含有抗生素的pbs清洗3次；

s2、将肺癌组织放入新的培养皿中并向其中加入少量的dmem培养基，使用眼科剪将组织剪成碎块，并转入15ml离心管中，用pbs冲洗3次，组织块自动下沉后，除去pbs；

s3、将组织块转入培养瓶中并向其中加入5ml复合酶溶液，吹散组织碎块，调节ph至7；然后将培养瓶置于恒温摇床上，在温度为37℃的条件下消化处理4min后，向其中加入胎牛血清终止消化，制成细胞悬液；

s4、每隔20min于显微镜下观察一次，待组织块镜下透光性良好且呈絮状时，转入15ml离心管中离心5min，并弃去上清液；

s5、向s4中盛有细胞悬液的培养瓶中加入含有由患者人体内提取的血清、青霉素和链霉素的培养基重悬沉淀物，并采用差速贴壁的方法取出成纤维细胞；

s6、向培养瓶中缓慢通入co2和o2持续120min，然后将培养品移至培养箱中培养30min后，弃去贴壁的成纤维细胞，将未贴壁的癌细胞悬液移至另一个洁净的培养瓶中，并移至培养箱中进行再次培养；

s7、定期更换培养基，待原代肿瘤细胞长满后，用胰蛋白酶消化，再经差速贴壁纯化后传代。

实施例2：

在取得病人知情同意后，于北京某肿瘤医院取得乳腺癌手术患者的肿瘤样本和正常样本，且患者性别为女性，年龄为52岁，临床诊断为her2阳性乳腺癌iii期。

s1、将新鲜乳腺癌肿瘤组织置于培养皿中，并向其中加入适量pbs，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留乳腺癌肿瘤细胞丰富的区域，并用含有抗生素的pbs清洗3次；

s2、将乳腺癌癌组织放入新的培养皿中并向其中加入少量的dmem培养基，使用眼科剪将组织剪成碎块，并转入15ml离心管中，用pbs冲洗3次，组织块自动下沉后，除去pbs；

s3、将组织块转入培养瓶中并向其中加入5ml复合酶溶液，吹散组织碎块，调节ph至7；然后将培养瓶置于恒温摇床上，在温度为37℃的条件下消化处理4min后，向其中加入胎牛血清终止消化，制成细胞悬液；

s4、每隔20min于显微镜下观察一次，待组织块镜下透光性良好且呈絮状时，转入15ml离心管中离心5min，并弃去上清液；

s5、向s4中盛有细胞悬液的培养瓶中加入含有由患者人体内提取的血清、青霉素和链霉素的培养基重悬沉淀物，并采用差速贴壁的方法取出成纤维细胞；

s6、向培养瓶中缓慢通入co2和o2持续120min，然后将培养品移至培养箱中培养30min后，弃去贴壁的成纤维细胞，将未贴壁的癌细胞悬液移至另一个洁净的培养瓶中，并移至培养箱中进行再次培养；

s7、定期更换培养基，待原代肿瘤细胞长满后，用胰蛋白酶消化，再经差速贴壁纯化后传代。

体外药敏试验：

以实施例1和实施例2中体外培养获得的大量增殖原代肿瘤细胞为实验对象，进行药敏检测。本实施例的细胞药敏检测既可在96孔板上进行，也可以在384孔板上进行。

待检测化学药物有阿帕替尼、舒尼替尼、紫杉醇和顺铂、拉帕替尼、多西他赛和氟脲嘧定、表柔比星、卡铂和长春瑞滨、曲妥珠单抗。

临床治疗效果：

由实施例1所得的体外药敏试验的图像(附图说明中的图1-图6)可得如下结论：

图1为胸水中分离得到的原代细胞；其中：

a为明亮视野下观察到的肺癌原代细胞；

b为he染色后观察到的肺癌原代细胞；

经检测得：分离肺癌中的原代细胞，得到细胞总数4×108，细胞活率92％。he染色结果显示大部分细胞是癌细胞，直径在15-30μm之间，核深染，核内有明显的异染色质区域，也有部分其他细胞混杂，红细胞极少。

图2为经过五天培养形成肿瘤细胞团；其中：

c为经过五天培养形成的肺癌原代细胞；

d为经过五天培养形成的肺肿瘤细胞团；

经检测，经过五天的培养，淋巴细胞、红细胞纤维细胞等杂细胞逐渐凋亡，肺肿瘤细胞扩增形成典型形态的肺肿瘤细胞团，悬浮生长。

由图3可知，原代肺肿瘤细胞团状态良好，增殖迅速，完全不受药物影响，结果呈阴性，表明阿帕替尼作为体外药对原代肺肿瘤细胞不起杀伤作用。

由图4可知，原代肿瘤细胞团完全解体，癌细胞大量凋亡，药物的杀伤效果明显，结果呈阳性，表明舒尼替尼作为体外药对原代肺肿瘤细胞起到很好的杀伤作用。

由图5可知原代肺肿瘤细胞团部分解体，癌细胞开始凋亡。药物有较明显的杀伤作用，紫杉醇和顺铂作为体外药敏试验的药品时对肺肿瘤细胞具有明显的杀伤效果。

由图6可知克唑替尼选择性杀伤部分肿瘤细胞团，部分耐药克隆存活，克唑替尼作为体外药敏试验的药品时对肺肿瘤细胞具有一定的杀伤效果。

主治医生参考药敏测试结果，为患者选择了克唑替尼靶向治疗方案，该方案在体外实验中表现为强阳性结果。病人使用该方案治疗两周期后进行评估，患者胸腔积液显著减少，肺癌组织pr，病情缓解。

由实施例2所得的体外药敏试验的图像(附图说明中的图7-图11)可得如下结论：

图7为穿刺患有her2阳性乳腺癌iii期的女性患者乳腺癌细胞后培养七天后所得的原代肿瘤细胞；

经检测，穿刺微量乳腺癌细胞操作，红细胞比例高，得到细胞总数2×106，细胞活率83％。经过7天培养，乳腺癌细胞扩增形成典型形态的肿瘤细胞团，悬浮生长。

由图8可知原代乳腺癌细胞团状态良好，增殖迅速，完全不受药物影响，呈阴性结果。表明多西他赛和氟脲嘧定作为体外药敏试验的药品时对乳腺癌细胞具有明显的杀伤效果。

由图9可知原代乳腺癌细胞团完全解体，癌细胞大量凋亡，药物的杀伤效果明显，呈阳性结果。表明表柔比星作为体外药敏试验的药品时对乳腺癌细胞具有明显的杀伤效果。

由图10可知原代乳腺癌细胞团部分解体，体积变小。药物有较明显的抑制作用。表明多西他赛和氟脲嘧定作为体外药敏试验的药品时对乳腺癌细胞具有一定的抑制作用。

由图11可知曲妥珠单抗选择性杀伤部分原代乳腺癌细胞团，部分耐药克隆存活。表明曲妥珠单抗作为体外药敏试验的药品时对乳腺癌细胞具有一定程度的杀伤作用。

主治医生参考药敏测试结果，为患者选择了表柔比星+卡铂+曲妥珠单抗的治疗方案进行新辅助化疗，该方案中的三个单药在体外实验中均有较好的效果。

病人使用上述方案化疗两周期后进行疗效评估，结果为pr，病情显著缓解。辅助化疗后病人手术顺利，目前病人状况良好。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。