本发明涉及1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物，具体涉及11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物及其合成方法和应用。
背景技术：
阿尔兹海默病(alzheimer'sdisease,ad)，通常称之为老年痴呆症，发现于上世纪初，是一种中枢神经退行性疾病。该病起病隐匿，临床表现为认知和记忆功能以及日常生活自理能力逐渐衰退，并且随着病情的发展会伴有各种精神症状和行为障碍。该病主要集中在65岁以上人群，并且发病率随着年龄的增加而升高。由于ad病涉及多种病理过程，其发病机制是个很复杂、多机制、多因素的过程。
阿尔兹海默病的临床表现出的主要病理特征是大脑皮层和海马区神经细胞外以β-淀粉样蛋白(aβ)聚集为核心形成的老年斑；细胞内以磷酸化tau蛋白为核心形成的神经纤维缠结；神经细胞和神经突触减少和丢失以及自噬功能障碍。上世纪80年代，bartus等人研究发现当ad患者的大脑皮层和海马区胆碱能的神经递质下降到一定水平时，胆碱能神经将会受到无法逆转的损伤，将会使得患者逐渐出现认知和记忆障碍，胆碱能假说由此提出。乙酰胆碱(acetylcholine,ach)是一种传出神经递质，存在于胆碱能突触中，在神经兴奋传导的过程中起着关键作用。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ache)主要存在于人体神经肌肉组织的突触后膜上，在神经传导过程中起重要作用。它能通过在胆碱能神经突触处快速水解乙酰胆碱，从而终止神经递质对突触后膜的兴奋传递，在胆碱能神经纤维的信号传导过程中起着重要作用。该学说认为，阿尔茨海默病由于患者大脑皮层和海马区胆碱能神经递质和乙酰胆碱的减少，从而抑制神经兴奋的传导，会使得胆碱能神经受到不可逆转的伤害，最终导致痴呆。基于“胆碱能缺失学说”，以及结合在之前对于该病治疗方法，研究主要是针对胆碱能的替代治疗。目前在临床上应用最为普遍的是乙酰胆碱酯酶抑制剂(acheis)。它可以通过抑制阿尔茨海默病患者乙酰胆碱酯酶活性，来抑制乙酰胆碱水解来维持患者的乙酰胆碱水平，改善ad患者的认知和记忆能力，从而缓解早期ad患者的病情。
血脑屏障是中枢神经系统免疫屏障之一，由脑毛细血管内皮细胞紧密相连，中枢神经系统疾病时常发生血脑屏障通透性的改变,了解某些药物通过血脑屏障的能力,在某些疾病的治疗中甚为重要。影响药物透过血脑屏障能力的因素有很多，主要有：电荷性、脂溶性、药物本身的相对分子质量、特定的载体或受体转运系统以及与血浆蛋白的结合能力等。研究表明，大部分作用于中枢神经系统的都是亲水的、大分子的药物，本身难以透过血脑屏障，而亲脂的、分子量适宜的药物较容易透过血脑屏障，致脑内有效药物浓度较高且作用时间较长，因而药效较好。药物对血脑屏障的透过能力是评价药物能否到达中枢神经系统产生药效的关键性因素，这也直接决定着其能否成为抗ad候选药物的关键指标。
1,6-二氮杂苯并蒽酮又名sampangine生物碱，从生长在亚洲的番荔枝科植物依兰树的茎皮中分离得到的，其结构如下式所示：
已有的研究表明，sampangine生物碱不但具有抑菌消炎作用，而且还具有改善心脑血管功能、免疫调节及抗肿瘤和抗艾滋病等作用，但其在抗胆碱酯酶方面的活性报道极少，仅有4-取代sampangine生物碱衍生物对乙酰胆碱酯酶具有一定的抑制活性(对乙酰胆碱酯酶的抑制ic50值为0.23～13.598μm)。目前尚未发现在sampangine生物碱母核的11位上接上取代基后，对乙酰胆碱酯酶抑制活性的相关报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一系列结构新颖的11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物，以及它们的合成方法和应用。
本发明所述的11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物为具有下述式(i)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，n＝1～3；r2为-n(ch3)2、-net2、
本发明所述11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物的合成方法，包括以下步骤：
1)对式(ⅱ)所示结构的4-甲基-1-氮杂-5,10-蒽醌进行硝化，得到式(ⅲ)所示结构的4-甲基-6-硝基-1-氮杂-5,10-蒽醌；
2)将式(ⅲ)所示结构的4-甲基-6-硝基-1-氮杂-5,10-蒽醌和硫化钠置于第一有机溶剂中反应，得到式(ⅳ)所示结构的4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌；
3)将式(ⅳ)所示结构的4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌置于第二有机溶剂中，加入n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(dmf-dma)反应，反应完成后再加入氯化铵和弱酸进行关环反应，得到式(ⅴ)所示结构的11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮；本步骤中涉及的反应在气氛保护条件下进行；
4)将式(ⅴ)所示结构的11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮和式(ⅵ)所示结构的酰氯置于第三有机溶剂中反应，即得到应的目标化合物粗品；其中：
所述的第一有机溶剂为选自甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或两种以上的组合；
所述的第二有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)和/或n,n-二甲基乙酰胺(dma)；
所述的第三有机溶剂为选自氯仿、二氯甲烷和乙腈的一种或两种以上的组合；
式(ⅱ)至式(ⅵ)所示结构的化合物分别如下所示：
式(ⅵ)中，n＝1～3；r2为-n(ch3)2、-net2、
上述合成方法的步骤1)中，采用现有常规方法实现对式(ⅱ)所示结构的4-甲基-1-氮杂-5,10-蒽醌的硝化，具体可以是用混酸实现对其的硝化等。所述的混酸为浓硫酸和硝酸或发烟硝酸的组合，其中浓硫酸的体积优选为硝酸或发烟硝酸的体积的2倍以上，更优选浓硫酸和硝酸或发烟硝酸的体积比为2.5～5：1。进行硝化时优选在冰浴条件下进行。
上述合成方法各步骤中，参加反应的原料的摩尔比为它们的化学计量比，在实际操作中，通常按以下摩尔比进行称量：
式(ⅱ)所示结构的4-甲基-1-氮杂-5,10-蒽醌与混酸的摩尔比为1：5～7，式(ⅲ)所示结构的4-甲基-6-硝基-1-氮杂-5,10-蒽醌和硫化钠的摩尔比为1：6.5～7，式(ⅳ)所示结构的4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌、n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(dmf-dma)和氯化铵的摩尔比为1：5：20，式(ⅴ)所示结构的11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮和式(ⅵ)所示结构的酰氯的摩尔比为1：5～10。所述的第一有机溶剂、第二有机溶剂和第三有机溶剂的用量通常以能够溶解参与反应的原料为宜。
所述第一有机溶剂中，各种醇可以是无水的，也可以是体积浓度≥10％的各种醇，优选体积浓度≥50％。
上述合成方法的步骤2)至步骤4)中，涉及的反应优选是在加热条件下进行。具体的，式(ⅲ)所示结构的4-甲基-6-硝基-1-氮杂-5,10-蒽醌和硫化钠的反应优选在50～100℃条件下进行，更优选在70～100℃条件下进行；式(ⅳ)所示结构的4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌和dmf-dma的反应以及之后加入氯化铵和弱酸后的关环反应均优选在50～120℃条件下进行，更优选在100～120℃条件下进行；式(ⅴ)所示结构的11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮和式(ⅵ)所示结构的酰氯的反应优选在50～110℃条件下进行，更优选在90～110℃条件下进行。可通过薄层层析跟踪检测反应是否完全。
上述合成方法的步骤2)中，所述的硫化钠可以是九水合硫化钠或无水硫化钠。
上述合成方法的步骤3)中，弱酸的加入是使体系呈现弱酸性，其加入量可根据需要确定，通常按1mmol的式(ⅳ)所示结构的4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌加入2～3mmol的弱酸计算。。所述的弱酸可以是现有技术中的常规选择，具体可以是选自醋酸和/或丙酸，优选为醋酸。
为了进一步提高目标化合物的产率，优选在步骤4)中，在反应之前加入缚酸剂。所述的缚酸剂为现有技术中的常规选择，具体可以是三乙胺或吡啶等。所述缚酸剂的用量通常按1mmol的式(ⅴ)所示结构的11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮加入2～5mmol的缚酸剂计算。
由上述方法制得的是式(i)化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高式(i)化合物的纯度。通常采用硅胶柱层析来进行纯化，在将制得的目标化合物粗品上硅胶柱层析时，通常用由氯仿和甲醇，或者是二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂洗脱，所述氯仿或二氯甲烷和甲醇体积比为80：1～20：1，收集洗脱液，洗脱液减压蒸除溶剂，得到纯化后的目标化合物。所述组成洗脱剂的氯仿或二氯甲烷和甲醇的体积比优选为50：1～20：1，更优选为30：1。
上述合成方法中，各步骤所得的中间产物均为粗品，为了减少引入到后续步骤中的杂质，同时提高目标物粗品的纯度，优选是将各步骤所得中间产物纯化后再用于后续步骤的操作中(对于式(ⅲ)所示结构的4-甲基-6-硝基-1-氮杂-5,10-蒽醌无需纯化即可进行还原)。所述的纯化可以是现有技术中常规的纯化操作，本申请中，可采用将中间产物上硅胶柱层析或重结晶的方式进行纯化，对于洗脱剂的选择具体如下：
式(ⅳ)所示结构的4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌纯化时的洗脱剂为二氯甲烷；
式(ⅴ)所示结构的11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮纯化时的洗脱剂为二氯甲烷。
由于本发明所述目标化合物11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物为生物碱，其合成过程中各步骤反应完成后的反应物料均需调节至弱碱性，以保证各中间产物的稳定性，优选是调节反应完成后所得反应物料的ph为8-10。
本发明还包括上述11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物或其医学上可接受的盐在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中的应用。具体可以是在制备治疗阿尔茨海默病、脑血管痴呆、青光眼或重症肌无力药物中的应用。
本发明还包括一种药物组合物，含有治疗上有效剂量的上述11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物或其医学上可接受的盐。
与现有技术相比，本发明提供了一系列结构新颖的11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物及其合成方法，此外，申请人通过实验发现，该类衍生物对乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制活性(很多均与他克林相当)，特别是化合物7f对乙酰胆碱酯酶的抑制活性的ic50值达到0.076μm；而且大多数化合物具有比4-取代sampangine生物碱衍生物更高的血脑屏障透过能力，具有很好的潜在药用价值，有望用于制备治疗阿尔茨海默病、脑血管痴呆以及类胆碱能的神经递质减少引起的相关神经系统疾病的药物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
根据下述合成路线合成本发明所述的11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物，其中化合物3对应于式(ⅱ)所示结构的4-甲基-1-氮杂-5,10-蒽醌，化合物4对应于式(ⅲ)所示结构4-甲基-6-硝基-1-氮杂-5,10-蒽醌，化合物5对应于(ⅳ)所示结构的4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌，化合物6对应于(ⅴ)所示结构的11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮，化合物7a-7i对应于式(i)所示结构的各目标化合物，结构式中出现的n＝1～3；r2为-n(ch3)2、-net2、
化合物7a-7i的结构分别如下：
实施例1：4-甲基-1-氮杂-5,10-蒽醌(化合物3)的合成
在电磁搅拌下，将化合物1(40.0g，169.5mmol)、二甲苯(500ml)、化合物2(28.2g,2.5mol)依次加到1l的圆底烧瓶中，回流6h(用tlc监测反应，展开剂：v乙酸乙酯:v石油醚＝1:1).反应完成后,冷却,将产物转移到萃取瓶中，用乙酸乙酯萃取(6×200ml),合并有机相,用2n硫酸萃取(4×500ml),得到的酸层溶液在冰浴中用6n氢氧化钠溶液中和,调ph＝9,抽滤,干燥,得到粗产品，用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝100：1)纯化得到化合物3为灰色固体,产率60％.
1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ:8.88(d,j＝4.8hz,1h),8.37–8.31(m,1h),8.26～8.20(m,1h),7.85～7.76(m,2h),7.48(dd,j＝4.8,0.9hz,1h),2.89(s,3h).13cnmr(126mhz,chloroform-d)δ:184.6,181.8,153.3,151.4,149.9,134.4,134.0,133.7,132.4,131.1,129.0,127.3,127.1,22.8.hrms(esi)m/zcalcdforc14h9no2[m+h]+:224.0706,found224.0710.
因此，确定化合物3的结构式如下：
实施例2：4-甲基-6-硝基-1-氮杂-5,10-蒽醌(化合物4)的合成
在电磁搅拌下,将化合物3(6.0g,26.9mol)加入100ml的圆底烧瓶中,在冰浴条件下,缓慢滴加浓硫酸(25ml),待化合物3完全溶解,再加入发烟硝酸(10ml)；反应24h(用tlc监测反应,展开剂：v乙酸乙酯:v石油醚＝2:1).反应完成后,将混合物缓慢加入到装有少量冰水的烧杯中,在冰浴中滴加6n氢氧化钠溶液中和,调ph＝10,冷却,抽滤,干燥,得到化合物4粗品(该产品无需纯化，可直接进行下一步还原)。
实施例3：4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌(化合物5)的合成
在电磁搅拌下,依次将化合物4粗品(5.0g)、九水合硫化钠(30.0g)、无水乙醇(250ml)加到500ml的圆底烧瓶中,回流5h(用tlc监测反应,展开剂：v乙酸乙酯:v石油醚＝2:1).反应完成后,冷却,抽滤,干燥,得到粗产品,经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷)纯化得到化合物5，为红色固体,产率约70％。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.79(d,j＝4.8hz,1h),7.90(s,2h),7.64(d,j＝4.5hz,1h),7.50(t,j＝7.8hz,1h),7.36(dd,j＝7.3,0.7hz,1h),7.20(dd,j＝8.4,0.6hz,1h),2.81(s,3h).13cnmr(100mhz,dmso)δ:186.4,181.9,152.4,151.7,150.0,149.2,134.3,133.2,131.5,129.9,123.8,115.3,112.5,22.8.hrms(esi)m/z:calcdforc14h11n2o2[m+h]+:239.0815,found239.0813.
取化学物5置于甲醇中结晶，所得晶体采用安捷伦公司supernova单晶衍射仪进行测定，所得晶体的晶体学数据、部分键长和部分键角分别如下述表1-3所示：
表1：化合物5的晶体学数据表
表2：化合物5的部分键长表
表3：化合物5的部分键角表
因此，确定化合物5的结构式如下：
实施例4：11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物6)的合成
在电磁搅拌下,将化合物5(4.3g,15.1mmol)、dmf-dma(10ml)、dmf(34ml)依次加入250ml的三颈烧瓶中,氮气保护下于120℃回流2h,用tlc监测反应,待原料反应完后,加入氯化铵(17.0g)、醋酸(64ml)；在120℃继续回流1h,用tlc监测反应,反应完成后,减压蒸馏,得到黑色残渣，加水(200ml)，用氨水调碱性至ph＝8,抽滤,用水洗涤,干燥.通过硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷)纯化得到化合物6为黄色固体,产率67％.
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.09(d,j＝5.4hz,1h),8.82(d,j＝5.8hz,1h),8.20(d,j＝5.4hz,1h),7.84(d,j＝5.8hz,1h),7.57(dd,j＝7.4,1.2hz,1h),7.42(t,j＝8.2hz,1h),7.24(dd,j＝8.3,1.2hz,1h).13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:182.2,154.4,150.5,148.8,147.6,145.7,138.7,133.8,131.7,124.6,123.9,119.9,117.3,117.1,113.0.hrms(esi)m/z:calcdforc15h10n3o[m+h]+:248.0818,found248.0815.
因此，确定化合物6的结构如下：
实施例5：11-(2-二乙胺基乙酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物7a)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.2mmol)、氯仿(100ml)和三乙胺(0.4ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有2-二乙胺基乙酰氯(0.36g,2.4mmol)的氯仿溶液(10ml),滴加完毕后,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,抽滤,用无水乙醚洗涤，烘干，得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝100:1)得到化合物7a的砖红色固体,产率约70％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:14.70(s,1h),9.40(d,j＝6.8hz,1h),9.17(d,j＝5.4hz,1h),8.82(d,j＝5.8hz,1h),8.29(dd,j＝7.7,1.3hz,1h),7.95(d,j＝5.5hz,1h),7.73(d,j＝5.8hz,1h),7.68(t,j＝8.1hz,1h),3.36(s,2h),2.80(s,4h),1.16(s,6h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.9,173.2,153.6,149.0,147.4,144.6,140.3,138.8,133.2,132.0,127.3,124.1,123.7,120.1,119.6,118.6,59.1,49.0,12.2.hrms(esi)m/z:calcdforc21h21n4o2[m+h]+:361.1659,found361.1655.
因此，确定化合物7a结构如下：
实施例6：11-(3-二乙胺基丙酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物7b)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.2mmol)、氯仿(100ml)和三乙胺(0.4ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有3-二乙胺基丙酰氯(0.39g,2.4mmol)的氯仿溶液(10ml),滴加完毕后,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,析出棕黄色固体,抽滤,用石油醚洗涤，烘干，得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝100:1)得到化合物7b为砖红色固体,产率约73％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:14.31(s,1h),9.14(d,j＝5.4hz,1h),9.08(d,j＝8.3hz,1h),8.90(d,j＝5.8hz,1h),8.19(d,j＝7.6hz,1h),7.91(d,j＝5.4hz,1h),7.70(d,j＝5.8hz,1h),7.59(t,j＝8.0hz,1h),3.26(t,j＝7.2hz,2h),3.06(t,j＝7.2hz,2h),2.93(q,j＝7.1hz,4h),1.27(t,j＝7.2hz,6h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.4,170.0,153.6,149.1,147.1,144.7,140.3,138.7,132.9,132.1,126.8,124.2,123.8,120.1,119.0,118.5,48.4,46.6,35.3,10.0.hrms(esi)m/z:calcdforc22h23n4o2[m+h]+:375.1816,found375.1811.
因此，确定化合物7b结构式如下：
实施例7：11-(4-二乙胺基丁酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物7c)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.2mmol)、氯仿(100ml)和三乙胺(0.40ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有4-二乙氨基丁酰氯(0.42g,2.4mmol)的氯仿溶液(10ml),滴加完毕后,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,析出固体,抽滤,用无水乙醚洗涤，烘干，得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝50：1)得到化合物7c为砖红色固体,产率约62％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:13.90(s,1h),9.14(dd,j＝8.4,1.0hz,1h),9.08(d,j＝5.4hz,1h),8.68(d,j＝5.8hz,1h),8.12(dd,j＝7.6,1.1hz,1h),7.86(d,j＝5.4hz,1h),7.64(d,j＝5.8hz,1h),7.56(t,j＝8.0hz,1h),2.60～2.55(m,8h),2.02～1.94(m,2h),1.03(t,j＝7.1hz,6h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.4,172.5,153.7,149.0,147.0,144.1,140.6,138.6,132.8,132.0,126.8,123.7,123.6,120.0,118.7,118.1,52.0,46.7,36.7,22.7,11.6.hrms(esi)m/z:calcdforc23h25n4o2[m+h]+:389.1972,found389.1966.
因此，确定化合物7c的结构式如下：
实施例8：11-(2-哌啶基乙酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物7d)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.21mmol)、乙腈(100ml)和三乙胺(0.4ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有2-哌啶基乙酰氯(0.39g,2.4mmol)的氯仿溶液(10ml),滴加完毕后,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,抽滤,残渣用无水乙醚洗涤，烘干，得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝50:1)得到化合物7d的砖红色固体,产率约65％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:14.45(s,1h),9.38(d,j＝7.8hz,1h),9.15(d,j＝5.4hz,1h),8.95(d,j＝5.8hz,1h),8.27(dd,j＝7.6,1.2hz,1h),7.94(d,j＝5.5hz,1h),7.72(d,j＝5.8hz,1h),7.66(t,j＝8.1hz,1h),3.30(s,2h),2.62(s,4h),1.75～1.69(m,4h),1.56(d,j＝4.9hz,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.8,171.3,153.8,149.0,147.3,144.9,140.3,138.8,133.2,132.0,127.4,124.2,123.7,120.1,119.5,118.5,64.8,55.0,26.023.7.hrms(esi)m/z:calcdforc22h21n4o2[m+h]+:373.1659,found373.1654.
因此，确定化合物7d的结构式如下：
实施例9：11-(3-哌啶基丙酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物7e)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.2mmol)、乙腈(100ml)和三乙胺(0.4ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有3-哌啶基丙酰氯(0.42g,2.4mmol)的氯仿溶液(10ml),滴加完毕后,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,抽滤,残渣用无水乙醚洗涤，烘干，得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝50:1)得到化合物7e为砖红色固体,产率约63％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:14.12(s,1h),9.16(m,2h),8.81(d,j＝4.9hz,1h),8.22(d,j＝7.0hz,1h),7.92(d,j＝4.2hz,1h),7.71(d,j＝4.8hz,1h),7.63(t,j＝7.6hz,1h),2.95(d,j＝5.8hz,2h),2.89(d,j＝5.6hz,2h),2.61(s,4h),1.67(s,4h),1.48(s,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.5,171.1,153.9,149.2,147.3,144.4,140.6,138.8,133.0,132.2,127.0,124.0,123.7,120.2,118.9,118.4,54.7,54.4,36.4,25.5,23.9.hrms(esi)m/z:calcdforc23h23n4o2[m+h]+:387.1816,found387.1808.
因此，确定化合物7e的结构式如下：
实施例10：11-(4-哌啶基丁酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(7f)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.2mmol)、氯仿(100ml)和三乙胺(0.4ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有4-哌啶基丁酰氯(0.45g,2.4mmol)的氯仿溶液(10ml),滴加完毕后,n2保护,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,析出黄色固体,抽滤,用无水乙醚洗涤，烘干，得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝50：1)得到化合物7f为黄色固体,产率约58％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:14.00(s,1h),9.18(d,j＝8.4hz,1h),9.12(d,j＝5.4hz,1h),8.76(d,j＝5.8hz,1h),8.19(d,j＝7.6hz,1h),7.90(d,j＝5.4hz,1h),7.69(d,j＝5.8hz,1h),7.61(t,j＝8.1hz,1h),2.61(t,j＝7.4hz,2h),2.52～2.46(m,6h),2.09～2.02(m,2h),1.63～1.57(m,4h),1.44(d,j＝4.9hz,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.5,172.5,153.9,149.1,147.2,144.3,140.7,138.7,132.9,132.1,127.0,123.9,123.7,120.1,118.8,118.3,58.4,54.5,37.0,25.8,24.3,22.6.hrms(esi)m/z:calcdforc24h25n4o2[m+h]+:401.1972,found401.1964.
因此，确定化合物7f的结构式如下：
实施例11：11-(2-n-甲基哌嗪基乙酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物7g)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.2mmol)、氯仿(100ml)和三乙胺(0.4ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有2-n-甲基哌嗪基乙酰氯(0.42g,2.4mmol)的氯仿溶液(10ml),滴加完毕后,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,抽滤,残渣用无水乙醚洗涤，烘干，得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝20:1)得到化合物7g的橙黄色固体,产率约70％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:14.39(s,1h),9.33(dd,j＝8.4,1.3hz,1h),9.13(d,j＝5.5hz,1h),8.95(d,j＝5.8hz,1h),8.25(dd,j＝7.6,1.3hz,1h),7.92(d,j＝5.5hz,1h),7.71(d,j＝5.8hz,1h),7.64(t,j＝8.1hz,1h),3.34(s,2h),2.74(s,4h),2.58(s,4h),2.36(s,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.7,170.8,153.8,149.0,147.2,144.8,140.2,138.8,133.1,132.0,127.3,124.1,123.7,120.0,119.4,118.5,64.0,55.0,53.5,46.2.hrms(esi)m/z:calcdforc22h22n5o2[m+h]+:388.1768,found388.1763.
因此，确定化合物7g的结构式如下：
实施例12：11-(3-n-甲基哌嗪基丙酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物7h)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.2mmol)、氯仿(100ml)和三乙胺(0.4ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有2-n-甲基哌嗪基乙酰氯(0.45g,2.4mmol)的氯仿溶液(10ml),滴加完毕后,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,抽滤,残渣用无水乙醚洗涤，烘干，得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝50:1)得到化合物7h为黄色固体,产率约62％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:14.13(s,1h),9.21(d,j＝8.5hz,1h),9.16(dd,j＝5.4,1.9hz,1h),8.79(dd,j＝5.6,3.6hz,1h),8.27～8.25(m,1h),7.95～7.94(m,1h),7.74(dd,j＝5.7,2.0hz,1h),7.66(t,j＝8.0hz,1h),3.0～2.96(m,2h),2.84～2.82(t,j＝2.6hz,2h),2.62(d,j＝55.4hz,8h),2.32(d,j＝3.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.4,171.0,153.9,149.1,147.2,144.2,140.6,138.7,132.9,132.2,127.0,124.0,123.7,120.2,118.9,118.3,54.7,54.0,52.7,45.7,36.5.hrms(esi)m/z:calcdforc23h24n5o2[m+h]+:402.1925,found402.1922.
因此，确定化合物7h的结构式如下：
实施例13：11-(4-n-甲基哌嗪基丁酰氨基)-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物7i)的合成
在电磁搅拌下,将化合物6(0.30g,1.2mmol)、二氯甲烷(100ml)和三乙胺(0.4ml,2.4mmol)依次加入200ml的圆底烧瓶中，待化合物6完全溶解,缓慢滴加溶有4-n-甲基哌嗪基丁酰氯(0.49g,2.4mmol)的乙腈溶液(10ml),滴加完毕后,n2保护,回流8h,用tlc监测反应,反应完成后,减压除去溶剂,加入水(50ml)搅拌,析出黄色固体,抽滤,用无水乙醚洗涤，烘干.得到的粗产品用硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝50：1)得到化合物7i为黄色固体,产率约60％.
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:13.95(s,1h),9.17(dd,j＝8.4,1.2hz,1h),9.10(d,j＝5.4hz,1h),8.72(d,j＝5.8hz,1h),8.17(dd,j＝7.6,1.2hz,1h),7.88(d,j＝5.5hz,1h),7.67(d,j＝5.8hz,1h),7.59(t,j＝8.1hz,1h),2.59(t,j＝7.4hz,4h),2.51～2.48(m,8h),2.24(s,3h),2.06～1.98(m,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.4,172.4,153.8,149.1,147.1,144.2,140.7,138.7,132.9,132.1,126.9,123.8,123.7,120.1,118.7,118.2,57.6,55.0,53.0,45.9,36.8,22.6.hrms(esi)m/z:calcdforc24h26n5o2[m+h]+:416.2081,found361.1655.
因此，确定化合物7i的结构式如下：
实施例14：4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌(化合物5)的合成
重复实施例3，不同的是，用体积浓度为75％的乙醇替代无水乙醇，且不加缚酸剂三乙胺。所得产物的产率为39％。
所得产物经核磁共振氢谱、碳谱表征及单晶衍射分析，确定为化合物5。
实施例15：4-甲基-6-氨基-1-氮杂-5,10-蒽醌(化合物5)的合成
重复实施例3，不同的是，用异丙醇替代无水乙醇，用无水硫化钠替代九水合硫化钠，反应在60℃进行，用tlc监测反应直至反应完全。所得产物的产率为42％。所得产物经核磁共振氢谱、碳谱表征及单晶衍射分析，确定为化合物5。
实施例16：11-氨基-1,6-二氮杂苯并蒽酮(化合物6)的合成
重复实施例4，不同的是，用n,n-二甲基乙酰胺(dma)替代dmf。所得产物的产率为61％。
所得产物经核磁共振氢谱和碳谱表征，确定为化合物6。
实验例1：本发明所述11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物体外乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性的测定。
应用ellman(ellman,g.l.；courtney,k.d.；andres,v.；etal.biochem.pharmacol.1961,7,88.)的方法测试化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制的ic50值。所有测试都是用microplatereaderelx808tm型酶标仪(美国biotek公司)，在37℃条件下测定。数据分析软件使用origin软件进行数据处理，使用tacrine作为对照品。
1、抑制剂储备液的配制：所测试的抑制剂配成10mm的dmso溶液。
2、酶储备液的配制：乙酰胆碱酯酶(从电鳗中提取)和丁酰胆碱酯酶(从马的血浆中提取)购自sigma公司；用ph＝8.0的磷酸盐缓冲液分别配成0.1mg/ml，0.5mg/ml。
3、底物储备液的配制：乙酰巯基胆碱(乙酰胆碱酯酶底物)和丁酰巯基胆碱(丁酰胆碱酯酶底物)购自sigma公司；用ph＝8.0的磷酸盐缓冲液分别配成2mg/ml，2mg/ml。
4、显色剂储备液的配制：显色剂dtnb购自sigma公司；用ph＝8.0的磷酸盐缓冲液分别配成4mg/ml和2mg/ml。
5、测试：每次测试的体积都为150μl的ph＝8.0的磷酸盐缓冲液。
往96孔酶标板中加入ph＝8.0磷酸盐缓冲溶液150μl，10μl显色剂储备液，10μl酶储备液，再分别加入20μl不同浓度抑制剂溶液(用ph＝8.0磷酸盐缓冲溶液稀释抑制剂储备液)，在37℃的酶标仪中保温15min，立即加入20μl底物储备液，混匀后立即测其在λ＝420nm处一分钟吸光度变化(斜率)。参比液为ph＝8.0磷酸盐缓冲溶液。
6、结果判断：以未加样品所测得的吸光度变化(斜率)作为100个活力单位；相对酶活力＝(加入抑制剂的吸光度变化(斜率)/没有加入抑制剂的吸光度变化(斜率))×100，当酶的相对活力为50时的抑制剂的浓度即为抑制剂的ic50值。结果如下述表4所示：
表4：化合物1,6-二氮杂苯并蒽酮，7a-7i对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性的ic50值
由体外乙酰胆碱酯酶的抑制实验可知，本发明所述的11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物普遍比已报道的4-取代sampangine生物碱衍生物具有更强的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中化合物7f最为显著，对乙酰胆碱酯酶的抑制ic50值达到了0.076μm；而化合物7b、7c、7e和7h均与对照品他克林的活性相当。
实验例2：本发明所述11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物血脑屏障透过能力测定
本发明采用kansy等(kansym.；sennerf.；gubernatork.j.med.chem.1998,41(7):1007-1010)建立的平行人工膜渗透模型(parallelartificialmembranepermeabilityassay,pampa)，采用猪脑脂质提取物(porcinebrainlipids,pbl)溶于十二烷，作为滤膜，模拟人脑内的脑磷脂，缓冲溶液的ph7.4与血液的ph一致。装置放置18h后测定供体池和受体池中溶液的浓度。
1、0.1mph7.4磷酸盐缓冲溶液(pbs)的配制：向250ml0.1mna2hpo4水溶液中缓慢滴加0.1mnah2po4水溶液，搅拌混匀，用ph计调溶液ph值至7.4，存储于4℃备用；
2、25μg/ml样品待测溶液的配制：先称取一定量的样品用dmso配制成5mg/ml的储备液，然后用pbs:乙醇(9:1,体积比)溶液稀释200倍，即得到25μg/ml样品待测溶液；
3、20mg/ml十二烷/pbl溶液(现配现用)的配制：称取20mgpbl溶于十二烷中，定容至1.0ml。
4、测试：取4μl20mg/ml十二烷/pbl溶液均匀分布于96#multi-wellfilterplate上层板的膜上，制成pvdf-pvdf磷脂膜，于摇床上震荡5min，使均匀分布，然后注入200μl已配好的pbs:乙醇(9:1,体积比)溶液，作为受体池；取200μl已配好的25μg/ml样品待测溶加入到下层板的供体池中，然后将其静置一段时间后，再将已制备好的受体池缓慢地移至供体池内，形成“三明治”结构；25℃下静止，被动扩散18h,。扩散实验完毕后，将上层板从下层板中小心取出，并分别吸取一定量的受体池和供体池中的溶液，分别移至96#uv透射板内，然后用m1000型多功能酶标仪测定其浓度[drug]acceptor和[drug]donor。根据下面公式，计算出所有化合物的pampa-bbb有效渗透率pe值，并参照7个市售药物的实验值和文献值(l.di；h.kernsedward；et.al.eur.j.med.chem.200338:223–232，如下述表5所示)，标定化合物pe值的可靠性。
其中，va为受体池中缓冲液的体积(ml)；vd为供体池中化合物待测液的体积(ml)；[drug]acceptor为受体池中药物的浓度；[drug]equilibrium为药物的理论吸收浓度；t为扩散时间(s)；a为人工磷脂膜的有效面积(cm2)；pe为药物有效透过率，单位为cm·s-1。
表5：7种市售药物的实验值和文献值
由表5可知，采用pbl模拟人脑内磷脂膜建立的pampa-bbb模型检测的7个市售的药物的血脑屏障透过性能力(pe(实验值))与文献值(pe(文献值))作对比，具有较好的相关性(相关性方程为：pe(实验值)＝0.79pe(文献值)+0.57(r2＝0.96))。由此我们推导出本发明的血脑屏障透过参考标准为：
1、‘cns+’(高血脑屏障透过)：pe(10-6cms-1)>3.7；
2、‘cns-’(不能透过血脑屏障)：pe(10-6cms-1)<2.1
本发明依据已经建立的pampa-bbb模型，预测了所合成的9个11-取代1,6-二氮杂苯并蒽酮衍生物对血脑屏障的透过能力。通过计算衍生物对pampa-bbb的有效透过率，预测其中枢神经系统透过能力。所得结果如表6所示：
表6：化合物1,6-二氮杂苯并蒽酮，7a-7i的血脑屏障透过能力和中枢神经系统渗透性预测
由表6可知，本发明所述所有化合物的有效透过系数pe值在7.91×10-6cm·s-1～10.12×10-6cm·s-1之间，普遍比已报道的4-取代sampangine生物碱衍生物(pe值在0.8×10-6cm·s-1～7.8×10-6cm·s-1之间)(k.-l.chenetal.inter.j.biolog.macromol.2018107：2725–2729)具有更强的血脑屏障透过能力。