本发明涉及酿酒技术领域，具体涉及一种耐酸己酸菌液的培养方法。
背景技术：
在浓香型大曲酒中，其主体香味物质己酸乙酯的窖内生化合成是由窖泥中的己酸菌代谢的己酸与糟醅体系中的乙醇缩合而成。因此，窖泥中己酸菌类芽孢杆菌的数量、质量与酒质的关系极大。在人工窖泥的培养及窖泥的养护中，人工培养窖泥功能菌起着重要的作用，其培养方式一般为己酸菌的培养。但是，白酒企业在窖泥养护的实际应用过程中发现，所培养己酸菌在窖泥ph值低于4.5的条件下进行窖泥养护，因窖泥的酸度太高，培养的己酸菌提高所产酒己酸乙酯的效果并不明显。
本发明公开了一种耐酸己酸菌液的培养方法，该方法采用的培养基包含的各个组分及其重量百分比为：naac：0.1～0.2%，（nh4）2so4：0.01～0.03%，k2hpo4：0.01～0.03%，mgso4：0.01～0.02%，酵母膏：0.1～0.2%，蛋白胨：0.1～0.2%，乙酸：0.04～0.06%，乳酸：0.02～0.03%，95%vol酒精：2～4%，ph：4.2～4.5。该方法制得的耐酸己酸菌用于ph值低于4.5的窖泥养护，可大大提高耐酸己酸菌的生存和代谢适应性，提高窖池的产己酸乙酯能力，从而有效提高基酒质量。
技术实现要素：
本发明所要解决技术问题是：如何提供一种耐酸己酸菌液的培养方法。该方法解决了白酒企业在窖泥养护的实际应用中，所培养的己酸菌液与ph值低于4.5的窖泥酸性环境不匹配，从而大大降低窖泥养护效果的实际问题。
为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：提供一种耐酸己酸菌液的培养方法，其特征在于：所述培养方法依次包括如下步骤：
三角瓶培养→卡氏罐培养→不锈钢种子罐培养→不锈钢发酵罐培养
三角瓶、卡氏罐、不锈钢种子罐、不锈钢发酵罐的接种量均为10％，三角瓶、卡氏罐、不锈钢种子、不锈钢发酵罐均用耐酸己酸菌培养基。
所述耐酸己酸菌培养基包含的各个组分及其质量百分比为：naac：0.1～0.2%，（nh4）2so4：0.01～0.03%，k2hpo4：0.01～0.03%，mgso4：0.01～0.02%，酵母膏：0.1～0.2%，蛋白胨：0.1～0.2%，乙酸：0.04～0.06%，乳酸：0.02～0.03%，95%vol酒精：2～4%，ph：4.2～4.5。
三角瓶培养：
a、在三角瓶中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基；
b、将三角瓶于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，将保藏的耐酸己酸菌液以10％的接种量加入三角瓶中，按配方要求加入95%vol酒精、乙酸、乳酸，密封，30～32℃培养7天。
卡氏罐培养：
a、在卡氏罐中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基；
b、将卡氏罐于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，将三角瓶耐酸己酸菌液以10％的接种量加入卡氏罐中，按配方要求加入95%vol酒精、乙酸、乳酸，密封，30～32℃培养7天。
不锈钢种子罐培养：
a、检查种子罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗种子罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；
b、按照配方，在种子罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容后关闭进料阀和搅拌器；
c、打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当种子罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；
d.将卡氏罐耐酸己酸菌液以10％的接种量加入种子罐中，再加入95%vol酒精、乙酸、乳酸，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
不锈钢发酵罐培养：
a、检查发酵罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗发酵罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；
b、按照配方，在发酵罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容后关闭进料阀和搅拌器；
c、打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当发酵罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；
d.将种子罐耐酸己酸菌液以10％的接种量加入不锈钢发酵罐中，再加入95%vol酒精、乙酸、乳酸，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
发酵期满，检测所制得的耐酸己酸菌的各指标如下：
外观：浅黄色；
气味：具有己酸气味；
ph：4.0～4.5；
耐酸己酸菌：≥1.0×108个/ml；
综上所述，本发明所提供的己酸菌液的培养方法尅解决一下问题：
（1）解决了目前己酸菌培养及应用与窖泥环境脱离和不匹配的问题；
（2）解决了目前己酸菌的人工培养及应用中缸式培养中操作繁琐、质量有限且不稳定的问题；
（3）解决了目前己酸菌使用效果欠佳的问题。
具体实施方式
本发明所提供的耐酸己酸菌液的培养方法依次包括如下步骤：
三角瓶培养：在三角瓶中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基；将三角瓶于0.1mpa高压灭菌30min，冷至32℃，将保藏的耐酸己酸菌液以10％的接种量加入三角瓶中，按配方要求加入95%vol酒精、乙酸、乳酸，密封，30～32℃培养7天。
所述耐酸己酸菌种为：四川省绵阳市丰谷酒业有限责任公司从丰谷天佑烧坊300多年老窖池中筛选的一株具有耐酸功能的己酸菌。
所述耐酸己酸菌培养基包含的各个组分及其质量百分比为：naac：0.1～0.2%，(nh4)2so4：0.01～0.03%，k2hpo4：0.01～0.03%，mgso4：0.01～0.02%，酵母膏：0.1～0.2%，蛋白胨：0.1～0.2%，乙酸：0.04～0.06%，乳酸：0.02～0.03%，95%vol酒精：2～4%，ph：4.2～4.5。
卡氏罐培养：在卡氏罐中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基；将卡氏罐于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，将三角瓶耐酸己酸菌液以10％的接种量加入卡氏罐中，按配方要求加入95%vol酒精、乙酸、乳酸，密封，30～32℃培养7天。
不锈钢种子罐培养：检查种子罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗种子罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；按照配方，在种子罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容后关闭进料阀和搅拌器；打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当种子罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；将卡氏罐耐酸己酸菌液以10％的接种量加入种子罐中，再加入95%vol酒精、乙酸、乳酸，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
不锈钢发酵罐培养：检查发酵罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗发酵罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；按照配方，在发酵罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容后关闭进料阀和搅拌器；打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当发酵罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；将种子罐耐酸己酸菌液以10％的接种量加入不锈钢发酵罐中，再加入95%vol酒精、乙酸、乳酸，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
发酵期满，检测所制得的耐酸己酸菌的各指标如下：
外观：浅黄色；
气味：具有己酸气味；
ph：4.0～4.5；
耐酸己酸菌：≥1.0×108个/ml；
具体实施例：
实施例1：
耐酸己酸菌培养基配方：naac：0.1%，(nh4)2so4：0.01%，k2hpo4：0.01%，mgso4：0.01%，酵母膏：0.1%，蛋白胨：0.1%，乙酸：0.04%，乳酸：0.02%，95%vol酒精：2%,ph：4.5。
三角瓶培养：a、在3只1000ml三角瓶中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基880ml；b、将三角瓶于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，分别接种100ml耐酸己酸菌种液，加入95%vol酒精20ml、乙酸0.4ml、乳酸0.2ml，密封，30～32℃培养7天。
卡氏罐培养：a、在25l卡氏罐中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基22l；b、将卡氏罐于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，以2.5l（即2500ml）耐酸己酸菌种液接种，加入95%vol酒精0.5l（即500ml）、乙酸10ml、乳酸5ml，密封，30～32℃培养7天。
250l不锈钢种子罐培养：a、检查种子罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗种子罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；b、按照耐酸己酸菌培养基的配方，在种子罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容到220l后关闭进料阀和搅拌器；c、打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当种子罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；d.将25l卡氏罐的己酸菌和液体窖泥混合菌液加入种子罐中，再加入95%vol酒精5l、乙酸100ml、乳酸50ml，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
2500l不锈钢发酵罐培养：a、检查发酵罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗发酵罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；b、按照耐酸己酸菌培养基的配方，在发酵罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容到2200l后关闭进料阀和搅拌器；c、打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当发酵罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；d.将250l不锈钢种子罐的己酸菌和液体窖泥混合菌液加入发酵罐中，再加入95%vol酒精50l、乙酸1l、乳酸0.5l，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
发酵期满，检测所制得的耐酸己酸菌液的各指标如下：外观：浅黄色；气味：带有己酸气味；ph：4.3；耐酸己酸菌：2.3×108个/ml。
实施例2：
乙酸：耐酸己酸菌培养基配方：naac：0.15%，(nh4)2so4：0.02%，k2hpo4：0.02%，mgso4：0.015%，酵母膏：0.15%，蛋白胨：0.15%，乙酸：0.05%，乳酸：0.02%，95%vol酒精：3%,ph：4.3。
三角瓶培养：a、在3只1000ml三角瓶中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基870ml；b、将三角瓶于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，分别接种100ml耐酸己酸菌种液，加入95%vol酒精30ml、乙酸0.5ml、乳酸0.2ml，密封，30～32℃培养7天。
卡氏罐培养：a、在25l卡氏罐中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基21.5l；b、将卡氏罐于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，以2.5l（即2500ml）耐酸己酸菌种液接种，加入95%vol酒精0.75l（即750ml）、乙酸12.5ml、乳酸5ml，密封，30～32℃培养7天。
250l不锈钢种子罐培养：a、检查种子罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗种子罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；b、按照耐酸己酸菌培养基的配方，在种子罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容到215l后关闭进料阀和搅拌器；c、打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当种子罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；d.将25l卡氏罐的己酸菌和液体窖泥混合菌液加入种子罐中，再加入95%vol酒精7.5l、乙酸125ml、乳酸50ml，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
2500l不锈钢发酵罐培养：a、检查发酵罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗发酵罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；b、按照耐酸己酸菌培养基的配方，在发酵罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容到2150l后关闭进料阀和搅拌器；c、打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当发酵罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；d.将250l不锈钢种子罐的己酸菌和液体窖泥混合菌液加入发酵罐中，再加入95%vol酒精75l、乙酸1.25l、乳酸0.5l，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
发酵期满，检测所制得的耐酸己酸菌液的各指标如下：外观：浅黄色；气味：带有己酸气味；ph：4.1；耐酸己酸菌：2.24×108个/ml。
实施例3：
耐酸己酸菌培养基配方：naac：0.2%，(nh4)2so4：0.03%，k2hpo4：0.03%，mgso4：0.02%，酵母膏：0.2%，蛋白胨：0.2%，乙酸：0.06%，乳酸：0.03%，95%vol酒精：4%,ph：4.2。
三角瓶培养：a、在3只1000ml三角瓶中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基860ml；b、将三角瓶于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，分别接种100ml耐酸己酸菌种液，加入95%vol酒精40ml、乙酸0.6ml、乳酸0.3ml，密封，30～32℃培养7天。
卡氏罐培养：a、在25l卡氏罐中装入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的耐酸己酸菌培养基21l；b、将卡氏罐于0.1mpa高压灭菌30min,冷至32℃，以2.5l（即2500ml）耐酸己酸菌种液接种，加入95%vol酒精1l、乙酸15ml、乳酸7.5ml，密封，30～32℃培养7天。
250l不锈钢种子罐培养：a、检查种子罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗种子罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；b、按照耐酸己酸菌培养基的配方，在种子罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容到210l后关闭进料阀和搅拌器；c、打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当种子罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；d.将25l卡氏罐的己酸菌和液体窖泥混合菌液加入种子罐中，再加入95%vol酒精10l、乙酸150ml、乳酸75ml，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
2500l不锈钢发酵罐培养：a、检查发酵罐，保证无漏水、漏电、漏汽，清洗发酵罐，然后关闭底阀和放菌种液阀，打开人孔盖、排汽阀和进料阀；b、按照耐酸己酸菌培养基的配方，在发酵罐中加入除95%vol酒精、乙酸、乳酸外的其它物料，打开搅拌器进行搅拌，定容到2100l后关闭进料阀和搅拌器；c、打开蒸汽阀进行煮料，保持煮沸状态30分钟，盖好人孔盖，当发酵罐内物料自然降温到60℃时，打开冷却水阀进行降温同时启动搅拌器进行搅拌，降温至32℃时关闭冷却水阀；d.将250l不锈钢种子罐的己酸菌和液体窖泥混合菌液加入发酵罐中，再加入95%vol酒精100l、乙酸1.5l、乳酸0.75l，搅拌均匀后关闭搅拌器和排汽阀，盖好人孔盖。保持温度在30～32℃范围内，培养7天。
发酵期满，检测所制得的耐酸己酸菌液的各指标如下：外观：浅黄色；气味：带有己酸气味；ph：4.0；耐酸己酸菌：2.10×108个/ml。
应用效果：按照实施例1培养的耐酸己酸菌液养护ph值低于4.5的窖泥的试验结果见表1，以下数据是养护一年后各试验组的平均值：
表1耐酸己酸菌液用于ph值低于4.5的窖泥养护试验结果
(单位：mg/100ml)
注：表中1＃为对照窖泥（ph值：4.21）发酵糟醅所产酒的检测结果；2＃为非耐酸己酸菌液养护窖泥发酵糟醅所产酒的检测结果；3＃为耐酸己酸菌液养护窖泥发酵糟醅所产酒的检测结果；1＃、2＃、3＃的发酵糟醅、发酵时间以及蒸馏、取样、检测方法完全一致。
从表1的试验结果可以看出，用耐酸己酸菌液养护ph值低于4.5的窖泥，提高基础酒己酸乙酯含量的效果明显。