一种产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

4-木糖醇脱氢酶第二个结构元素和序列与典型短链脱氢酶一致，其氨基酸基因序列与短链脱氢酶/还原酶家族成员有高度相似性，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可合成多种碳水化合物。目前，xdh酶能催化木糖醇进行氧化反应生成l-木酮糖，利用单一底物木糖醇生产l-木酮糖。

随着糖尿病、肥胖等健康问题的普及，人们对低糖食品、功能性调味剂以及一些低卡路里的甜味剂倾注了越来越多的关注。其中很大一部分是关于稀有糖的研究和开发。l-木酮糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂，可以用于糖尿病患者血液中葡萄糖水平的降低。目前，已有以l-木酮糖作为主要成分的降血糖药物通过审核。由于体内葡萄糖内酯主要在肝脏内代谢，代谢产物包括l-木酮糖，因此，尿液中的l-木酮糖的含量变动可以表征这一代谢过程的正常与否。由此可知l-木酮糖在医疗保健等领域发具有很大的应用前景。

自然界中，l-木酮糖的含量极少，有l-木酮糖制备方法的研究报道较少。目前，l-木酮糖的生产方法有化学法和生物法。化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化困难、产物得率低等问题。4-木糖醇脱氢酶(xylitol4-dehydrogenase，ec1.1.1.10)隶属氧化还原酶，能够在nad⁺存在的情况下氧化木糖醇生成l-木酮糖。在这种情况下，对辅因子进行控制对进一步提高目的产物产量来说非常关键。通过辅因子再生技术生物转化合成产物，基于长远考虑是最具潜力的。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一株产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌，可转化木糖醇生成l-木酮糖，对l-木酮糖的生产具有重要的意义。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sk46.001，已于2017年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，武汉大学，保藏编号cctccno:m2017165。

本发明的第二个目的是提供一种组合物，所述组合物包括所述产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌活性成分。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物含有所述产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物为药物。

在本发明的一种实施方式中，所述药物由所述产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌细胞和药学上可接受的载体组成。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物为食品。

在本发明的一种实施方式中，所述食品由所述枯草芽孢杆菌的发酵液和食品上可接受的载体组成。

本发明的第三个目的是提供所述枯草芽孢杆菌的应用，具体用于化学、食品及制药领域。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是应用所述枯草芽孢杆菌生产l-木酮糖，所述方法包括向终浓度为20-100g/l的木糖醇加入2×10⁹～1.5×10¹⁰cfu菌体/g木糖醇的细胞，37℃保温3-24h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体步骤为：以含20-100g/l的木糖醇的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(50mm，ph10.0)为反应体系，按照2×10⁹～1.5×10¹⁰cfu菌体/g木糖醇的浓度加入枯草芽孢杆菌细胞，37℃保温3-24h。

本发明还要求保护所述枯草芽孢杆菌在生产含l-木酮糖的产品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。

本发明的有益效果：本发明提供的枯草芽孢杆菌可以木糖醇为底物，生产l-木酮糖，经验证，该菌株能够产4-木糖醇脱氢酶，酶活达到0.95u/ml。应用该菌株通过发酵法制备l-木酮糖具有安全环保的特点，在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。

生物材料保藏

一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sk46.001，分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sk46.001，已于2017年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，武汉大学，保藏编号cctccno:m2017165。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌sk46.001产4-木糖醇脱氢酶验证；其中，自左向右第一条泳道为2000marker；第二泳道为xdh基因(795bp)；

图2为枯草芽孢杆菌sk46.001发酵及酶活曲线；

图3为枯草芽孢杆菌sk46.001转化生产l-木酮糖的曲线。

具体实施方式

用半胱氨酸咔唑比色法检测l-木酮糖的生成量：将转化液经适当稀释后，移取1ml转化液，加入0.2ml半胱氨酸盐酸盐溶液，6ml硫酸溶液，摇匀后立即加入0.2ml咔唑酒精溶液，60℃水浴保温10min，冷却10min。以空白调零，在560nm处测定吸光度。

计算生产的木酮糖含量，计算酶活。酶活单位(u/ml)：每毫升发酵液每分钟产生1μgl-木酮糖的酶量为1个酶活力单位。

实施例1菌株产4-木糖醇脱氢酶的能力验证

设计p1:5-gggaattccatatgagcggtgaatatgacgttaacctgcg-3和p2：5-cgggatccttaatgatgatgatgatgccagatggtaaagcca-3两条引物，对菌株编码4-木糖醇脱氢酶的基因进行验证，结果显示扩增出一条795bp左右的片段，说明该菌株存在编码4-木糖醇脱氢酶的基因，见图1。

实施例2枯草芽孢杆菌sk46.001的培养和发酵

种子培养基：胰蛋白胨(10g/l)，酵母提取物(5g/l)，nacl(10g/l)，以双蒸水配制。

发酵培养基：胰蛋白胨(10g/l)，酵母提取物(5g/l)，nacl(10g/l)，蔗糖(5g/l)，尿素(5g/l)，feso4·7h2o(0.01g/l)，mgso4(0.05g/l)，mnso4(0.01g/l)，ph8.0，以双蒸水配制。

用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37℃，200rpm，培养12～14h。以2％的接种量接种至发酵培养基中，37℃，200rpm，并定时取样，测定od600，酶活数据见图2。枯草芽孢杆菌sk46.001发酵15h酶活为0.95u/ml，od达到2.6；发酵21h酶活为0.44u/ml，od为1.88。

实施例3l-木酮糖的转化生产

(1)全细胞转化：1ml的反应体系中，加入1ml的用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(50mm，ph10.0)溶解的20g/l的木糖醇，1ml的发酵液离心收集得到的菌体，37℃保温3h，然后煮沸10min以终止酶反应。

(2)用半胱氨酸咔唑比色法检测l-木酮糖的生成量，计算酶活。转化液经适当稀释后，移取1ml转化液，加入0.2ml15g/l的半胱氨酸盐酸盐溶液，6ml体积分数为70％的硫酸溶液，摇匀后立即加入0.2ml1.2g/l咔唑酒精溶液，60℃水浴保温10min，冷却10min。以空白调零，在560nm处测定吸光度。通过标准曲线计算生产的木酮糖含量，计算酶活。

结果如图3所示，反应3h，l-木酮糖的产量达148mg/l；反应6h后，l-木酮糖的产量达到175mg/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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