一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法与流程

本发明涉及化合物制备技术领域，尤其涉及一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法。

背景技术：

马来酰亚胺基烷基酰肼是一种含有酰肼结构的蛋白质交联剂，其结构中的马来酰亚胺基端可以与蛋白结构中的巯基发生化学偶联，另一端的酰肼结构可以与化学中的基团发生化学反应，最终获得蛋白与化学药的桥接偶联，使药物具备靶向作用，是抗体偶联（adc）药物的关键试剂，已报道的马来酰亚胺基烷基酰肼合成方法，存在起始原料价格高、纯度差、单一酰肼选择性差、收率低等问题，国内外抗体偶联药物行业对高纯度、低成本的马来酰亚胺基烷基酰肼需求越来越大，设计和开发高效、经济、绿色的符合工业化生产合成路线，具有较大经济价值和意义；

关于马来酰亚胺基烷基酰肼的合成方法，目前合成路线很少，其中一条合成路线，路线如结构（iv）所示：

结构（iv）；

该路线使用马来酰亚胺基烷基酸琥珀酰亚胺酯作为原料，该原料价格较昂贵，性质不稳定，容易聚合，同时由于使用水合肼做原料，存在单保护选择性差，产品纯度低的缺点，大大过量使用水合肼虽然解决了选择性的问题，但也存在浓缩反应液时危险系数高，水和肼残留具有致癌性，因此，使用该方法生产的马来酰亚胺基烷基酰肼在抗体偶联药物行业中使用具有很大的局限性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法，以解决上述背景技术中提出的合成路线收率较低、水和肼残留、不易工业化生产和成本高的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法，包括以下步骤；

步骤一、将马来酰亚胺基烷基酸即化合物a在溶剂和氯化亚砜作用下，通过加热反应将化合物a结构中的羧基转变成酰氯，所述化合物a与氯化亚砜的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0，所述加热反应温度为25℃-80℃，反应时间1-8h；

步骤二、将步骤一得到的马来酰亚胺基烷基酰氯在溶剂和各类型化合物b混合，在有机或无机碱的作用下，通过酰基化反应生成化合物c，所述酰氯与化合物b的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.2，反应时间1-8h；

步骤三、化合物c在溶剂和酸或者碱的作用下，脱除肼端的保护基，得到含有酰肼结构马来酰亚胺基烷基酰肼，所述化合物c与酸的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.5，反应时间1-8h；所述化合物c与碱的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0。

本发明所述的具体制备过程结构式如下所示：

结构式（i）；

结构式（ii）；

结构式（iii）。

优选的，步骤一中，所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷等非质子性溶剂；所述反应完成后还包括：浓缩除去溶剂以及过量的氯化亚砜，加入适量溶剂第二次浓缩除去微量残留的氯化亚砜。

优选的，步骤二中，所述化合物b为boc肼、丙酮腙、苯甲醛腙、fmoc-肼等带保护基的肼；所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机碱包括：吡啶、三乙胺、三正丙胺、二异丙基乙胺、三正丁胺以及dbu；所述无机碱包括：碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸锂和碳酸氢钠。

优选的，步骤三中，所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机酸包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、乙酸等；所述碱包括：哌啶、dbu、吡啶、吗啉等有机强碱。

本发明提出的一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法，有益效果在于：

1、本发明以廉价易得的马来酰亚胺基烷基酸为起始原料，经过三步反应得到化合物马来酰亚胺基烷基酰肼，合成路线收率较高，可达65%；

2、本发明的合成方法可以有效避免产品中水和肼残留，产品适合用于抗体偶联药物的研发与生产；

3、本发明的合成方法涉及的操作简便、安全可控，易于工业化生产；

4、本发明不涉及昂贵试剂的使用，成本低。

附图说明

图1为本发明马来酰亚胺基烷基肼结构式图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，参照图1，一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法，包括以下步骤；

步骤一、将马来酰亚胺基烷基酸即化合物a在溶剂和氯化亚砜作用下，通过加热反应将化合物a结构中的羧基转变成酰氯，所述化合物a与氯化亚砜的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0，所述加热反应温度为25℃-80℃，反应时间1-8h；其具体制备过程如结构式（i）所示：

结构式（i）；

所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷等非质子性溶剂；所述反应完成后还包括：浓缩除去溶剂以及过量的氯化亚砜，加入适量溶剂第二次浓缩除去微量残留的氯化亚砜；

步骤二、将步骤一得到的马来酰亚胺基烷基酰氯在溶剂和各类型化合物b混合，在有机或无机碱的作用下，通过酰基化反应生成化合物c，所述酰氯与化合物b的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.2，反应时间1-8h；其具体制备过程结构式（ii）所示：

结构式（ii）；

所述化合物b为boc肼、丙酮腙、苯甲醛腙、fmoc-肼等带保护基的肼；所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机碱包括：吡啶、三乙胺、三正丙胺、二异丙基乙胺、三正丁胺以及dbu；所述无机碱包括：碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸锂和碳酸氢钠；

步骤三、化合物c在溶剂和酸或者碱的作用下，脱除肼端的保护基，得到含有酰肼结构马来酰亚胺基烷基酰肼，所述化合物c与酸的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.5，反应时间1-8h；所述化合物c与碱的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0；其具体制备过程结构式（iii）所示：

结构式（iii）；

所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机酸包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、乙酸等；所述碱包括：哌啶、dbu、吡啶、吗啉等有机强碱；

具体制备过程：

s1、将马来酰亚胺基丁酸18.3g加入到80ml二氯甲烷中，然后加入14.1g氯化亚砜，加入一滴dmf，接鼓泡器观察反应生成气体，将反应液升温至回流反应3h至鼓泡器无气体时停止反应，将反应液浓缩干，加入30ml二氯甲烷继续浓缩一次，得到粘稠液体不用后处理，直接进行下一步反应；

s2、将得到的粘稠液体加入100ml二氯甲烷搅拌，然后加入boc-肼12.9g，控制温度5-10℃滴加三乙胺11.1g，滴完后继续保持5-10℃反应3h，反应液用20ml0.5mol/l的盐酸洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩干得到化合物n-boc-马来酰亚胺基丁酰肼的白色固体粉末26.4g，两步收率88.8%；

数据如下：

1h-nmr(500mhz,cdcl3):1.26(s,9h),1.85(m,2h),2.15(t,2h),3.52(t,2h),6.51(s,2h),7.95-8.01(s,2h)；

s3、将得到的n-boc-马来酰亚胺基丁酰肼26.4g加入到100ml乙酸乙酯中，再加入10ml浓盐酸，室温搅拌4-8h，tlc检测反应结束，反应液浓缩除去乙酸乙酯，然后加入10%碳酸氢钠8.3g，搅拌打浆1h之后过滤，滤饼用水20ml洗涤，真空干燥得到化合物马来酰亚胺基丁酰肼的白色固体粉末13.8g，收率78.1%；

数据如下：

1h-nmr(500mhz,dmso):1.83-1.6(m,2h),2.15-2.19(t,2h),3.52-3.54(t,2h),5.52(b,2h),6.50(s,2h),8.13(s,1h)。

实施例2，参照图1，一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法，包括以下步骤；

步骤一、将马来酰亚胺基烷基酸即化合物a在溶剂和氯化亚砜作用下，通过加热反应将化合物a结构中的羧基转变成酰氯，所述化合物a与氯化亚砜的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0，所述加热反应温度为25℃-80℃，反应时间1-8h；其具体制备过程如结构式（i）所示：

结构式（i）；

所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷等非质子性溶剂；所述反应完成后还包括：浓缩除去溶剂以及过量的氯化亚砜，加入适量溶剂第二次浓缩除去微量残留的氯化亚砜；

步骤二、将步骤一得到的马来酰亚胺基烷基酰氯在溶剂和各类型化合物b混合，在有机或无机碱的作用下，通过酰基化反应生成化合物c，所述酰氯与化合物b的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.2，反应时间1-8h；其具体制备过程结构式（ii）所示：

结构式（ii）；

所述化合物b为boc肼、丙酮腙、苯甲醛腙、fmoc-肼等带保护基的肼；所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机碱包括：吡啶、三乙胺、三正丙胺、二异丙基乙胺、三正丁胺以及dbu；所述无机碱包括：碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸锂和碳酸氢钠；

步骤三、化合物c在溶剂和酸或者碱的作用下，脱除肼端的保护基，得到含有酰肼结构马来酰亚胺基烷基酰肼，所述化合物c与酸的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.5，反应时间1-8h；所述化合物c与碱的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0；其具体制备过程结构式（iii）所示：

结构式（iii）；

所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机酸包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、乙酸等；所述碱包括：哌啶、dbu、吡啶、吗啉等有机强碱；

具体制备过程：

s1、将马来酰亚胺基氨甲环酸23.7g加入到80ml甲苯中，然后加入15.2g氯化亚砜，加入一滴dmf，接鼓泡器观察反应生成气体，将反应液升温至回流反应4h至鼓泡器无气体时停止反应，将反应液浓缩干，加入40ml甲苯继续浓缩一次，得到粘稠液体不用后处理，直接进行下一步反应；

s2、将得到的粘稠液体加入20ml1,2-二氯乙烷搅拌，然后加入丙酮腙7.2g，控制温度10-15℃滴加吡啶9.5g，滴完后继续保持10-15℃反应4h，反应液用20ml水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩干后加入少量乙醇打浆，抽滤后烘干得到马来酰亚胺基酰肼丙酮腙的白色固体粉末23.9g，两步收率82.1%，；

数据如下：

1h-nmr(500mhz,dmso):1.12(s,6h),1.41-1.48(m,4h),1.69-1.72(m,4h),2.08-2.13(m,1h),2.38-2.41(m,1h),3.50-3.52(d,2h),7.01(s,2h),8.25(s,1h)；

s3、将得到的马来酰亚胺基酰肼丙酮腙23.9g加入到100ml二氧六环中，再加入20ml浓盐酸，室温搅拌6-8h，tlc检测反应结束，反应液浓缩除去二氧六环，然后加入10%碳酸氢钠16.2g，搅拌打浆1h之后过滤，滤饼用水20ml洗涤，真空干燥得到马来酰亚胺基氨基环酰肼的白色固体粉末14.6g，收率71.2%；

数据如下：

1h-nmr(500mhz,dmso):1.40-1.46(m,4h),1.68-1.72(m,4h),2.09-2.14(m,1h),2.43-2.48(m,1h),3.50-3.52(d,2h),5.12(b,2h),7.01(s,2h),8.25(s,1h)。

实施例3，参照图1，一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法，包括以下步骤；

步骤一、将马来酰亚胺基烷基酸即化合物a在溶剂和氯化亚砜作用下，通过加热反应将化合物a结构中的羧基转变成酰氯，所述化合物a与氯化亚砜的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0，所述加热反应温度为25℃-80℃，反应时间1-8h；其具体制备过程如结构式（i）所示：

结构式（i）；

所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷等非质子性溶剂；所述反应完成后还包括：浓缩除去溶剂以及过量的氯化亚砜，加入适量溶剂第二次浓缩除去微量残留的氯化亚砜；

步骤二、将步骤一得到的马来酰亚胺基烷基酰氯在溶剂和各类型化合物b混合，在有机或无机碱的作用下，通过酰基化反应生成化合物c，所述酰氯与化合物b的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.2，反应时间1-8h；其具体制备过程结构式（ii）所示：

结构式（ii）；

所述化合物b为boc肼、丙酮腙、苯甲醛腙、fmoc-肼等带保护基的肼；所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机碱包括：吡啶、三乙胺、三正丙胺、二异丙基乙胺、三正丁胺以及dbu；所述无机碱包括：碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸锂和碳酸氢钠；

步骤三、化合物c在溶剂和酸或者碱的作用下，脱除肼端的保护基，得到含有酰肼结构马来酰亚胺基烷基酰肼，所述化合物c与酸的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.5，反应时间1-8h；所述化合物c与碱的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0；其具体制备过程结构式（iii）所示：

结构式（iii）；

所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机酸包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、乙酸等；所述碱包括：哌啶、dbu、吡啶、吗啉等有机强碱；

具体制备过程：

s1、将马来酰亚胺基己酸21.1g加入到100ml乙酸乙酯中，然后加入16.2g氯化亚砜，加入一滴dmf，接鼓泡器观察反应生成气体，将反应液升温至回流反应3h至鼓泡器无气体时停止反应，将反应液浓缩干，加入60ml乙酸乙酯继续浓缩一次，得到黄色固体不用后处理，直接进行下一步反应；

s2、将得到的黄色固体加入120ml乙腈搅拌，然后加入苯腙12.0g，控制温度10-15℃滴加dbu15.2g，滴完后继续保持10-15℃反应4h，反应液浓缩干，用40ml水升温回流打浆20min，过滤、烘干得到马来酰亚胺基己基酰肼苯腙的白色固体粉末24.7g，两步收率78.9%；

数据如下：

1h-nmr(500mhz,dmso):1.12(s,6h),1.41-1.48(m,4h),1.69-1.72(m,4h),2.08-2.13(m,1h),2.38-2.41(m,1h),3.50-3.52(d,2h),7.01(s,2h),8.25(s,1h)；

s3、将马来酰亚胺基己基酰肼苯腙24.7g加入到100ml四氢呋喃中，再加入20ml浓盐酸，加热至回流反应4h，tlc检测反应结束，反应液浓缩除去四氢呋喃以及副产物苯甲醛，然后加入10%碳酸氢钠20g，搅拌打浆1h之后过滤，滤饼用水25ml洗涤，真空干燥得到化合物马来酰亚胺基氨基己基酰肼的白色固体粉末15.5g，收率77.1%；

数据如下：

1h-nmr(500mhz,dmso):1.38-1.40(m,2h),1.55-1.57(m,2h),1.63-1.67(m,2h),2.31-2.33(t,2h),3.48-3.52(t,2h),5.12(b,2h),6.93(s,2h),8.01(s,1h)。

实施例4，参照图1，一种含有酰肼结构异双功能蛋白质交联剂的制备方法，包括以下步骤；

步骤一、将马来酰亚胺基烷基酸即化合物a在溶剂和氯化亚砜作用下，通过加热反应将化合物a结构中的羧基转变成酰氯，所述化合物a与氯化亚砜的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0，所述加热反应温度为25℃-80℃，反应时间1-8h；其具体制备过程如结构式（i）所示：

结构式（i）；

所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷等非质子性溶剂；所述反应完成后还包括：浓缩除去溶剂以及过量的氯化亚砜，加入适量溶剂第二次浓缩除去微量残留的氯化亚砜；

步骤二、将步骤一得到的马来酰亚胺基烷基酰氯在溶剂和各类型化合物b混合，在有机或无机碱的作用下，通过酰基化反应生成化合物c，所述酰氯与化合物b的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.2，反应时间1-8h；其具体制备过程结构式（ii）所示：

结构式（ii）；

所述化合物b为boc肼、丙酮腙、苯甲醛腙、fmoc-肼等带保护基的肼；所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机碱包括：吡啶、三乙胺、三正丙胺、二异丙基乙胺、三正丁胺以及dbu；所述无机碱包括：碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸锂和碳酸氢钠；

步骤三、化合物c在溶剂和酸或者碱的作用下，脱除肼端的保护基，得到含有酰肼结构马来酰亚胺基烷基酰肼，所述化合物c与酸的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:1.5，反应时间1-8h；所述化合物c与碱的摩尔量之比为1.0:1.0-1.0:2.0；其具体制备过程结构式（iii）所示：

结构式（iii）；

所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯或1，2-二氯乙烷、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等常规溶剂；所述有机酸包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、乙酸等；所述碱包括：哌啶、dbu、吡啶、吗啉等有机强碱；

具体制备过程：

s1、将十一烷基马来酰亚胺基-11-酸28.1g加入120ml氯化亚砜中，将反应液升温至回流反应3h至鼓泡器无气体时停止反应，将反应液浓缩干，加入60ml二氯甲烷继续浓缩一次，得到黄色固体不用后处理，直接进行下一步反应；

s2、黄色固体加入120ml二氯甲烷搅拌，然后加入fmoc-肼25.4g，控制温度15-20℃滴加三正丁胺18.5g，滴完后继续保持15-20℃反应4h。反应液浓缩干，用四氢呋喃50ml打浆两次后过滤，除去三正丁胺盐酸盐副产物，固体收集烘干得到化合物n’-fmoc-十一烷基马来酰亚胺基-11-酰肼的类白色固体粉末35.7g，收率69.2%；

数据如下：

1h-nmr(500mhz,dmso):1.26-1.36(m,12h),1.55-1.57(m,4h),2.20-2.22(t,2h),3.50-3.52(t,2h),4.40-4.42(t,1h),4.70-4.72(d,2h),6.95(s,2h),7.28-7.84(m,8h),8.22-8.26(d,2h)；

s3、将得到的n’-fmoc-十一烷基马来酰亚胺基-11-酰肼35.7g加入到200ml四氢呋喃中，再加入20g哌啶，室温搅拌4h，tlc检测反应结束，反应液浓缩除去四氢呋喃，然后加入甲醇60ml搅拌打浆1h之后过滤，真空干燥得到化合物十一烷基马来酰亚胺基-11-酰肼的白色固体粉末13.6g，收率67.2%；

数据如下：

1h-nmr(500mhz,dmso):1.26-1.36(m,12h),1.58-1.62(m,4h),2.20-2.23(t,2h),3.48-3.50(t,2h),5.75(s,1h),6.94(s,2h),8.10(b,2h)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。