一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用与流程

本发明涉及血液病分子诊断学领域，具体涉及一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用。
背景技术：
：先天性骨髓衰竭综合征，即遗传性骨髓衰竭综合征(inheritedbonemarrowfailuresyndrome，ibmfs)是一组由先天性造血干细胞功能衰竭而导致的一系或多系血细胞生成减少或功能障碍的遗传综合征。此类疾病临床表现为新生儿期或儿童期的进行性骨髓衰竭(少数患者也可直至成人期才出现典型的临床表现)、可累及多器官的先天性发育异常，并具有向生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、和急性髓系白血病等疾病转化的倾向。先天性骨髓衰竭综合征患者临床表现具有高度异质性，这与其发病因素的多样性密切相关。研究表明，先天性骨髓衰竭综合征为单基因遗传病，至今已发现数十种相关的致病突变基因。根据受累基因以及发病机制的不同，可将先天性骨髓衰竭综合征分为范可尼贫血、遗传性角化不良、shwachman-diamond综合征、diamond-blackfan贫血、先天性无巨核细胞性血小板减少症、血小板减少伴桡骨缺失综合征和重型先天性中性粒细胞减少等亚型。然而，不仅不同亚型间临床表型相互重叠，而且还容易与其他疾病相混淆。此外，不同亚型的先天性骨髓衰竭综合征对应的治疗策略与临床预后也不尽相同。因此，明确骨髓衰竭综合征的基因型，对于该疾病的诊断、分型、治疗决策以及预后评估均具有重要意义。近年来，精准医疗的理念已普及至各大医院及科研机构，基于分子生物学层面对先天性骨髓衰竭综合征进行诊断与分型已显得极其重要。传统的sanger法测序检测存在检测位点有限、多位点检测工艺繁杂等问题。而最新的基于高通量测序法进行的基因检测，良好地弥补了传统检测方法的相关缺点，已逐渐成为市面上遗传病基因检测的主流方法。然而，现有技术中尚未有能够辅助实现骨髓衰竭综合征进行精准分型、治疗指导的基因组合、高通量测序文库及其构建方法的相关报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够辅助实现骨髓衰竭综合征进行精准分型、治疗指导的基因组合、引物库、高通量测序文库及其构建方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合，所述基因组合包含acd、csf3r、ctc1、dkc1、elane、fanca、fancb、fancc、fancd1、fancd2、fance、fancf、fancg、fanci、fancj、fancl、fancm、fancn、fanco、fancp、fancq、fancr、fancs、fanct、fancu、fancv、fancw、g6pc3、gata1、gata2、gfi1、hax1、jagn1、mpl、nhp2、nop10、parn、rbm8a、rpl11、rpl15、rpl17、rpl19、rpl26、rpl31、rpl35a、rpl5、rps10、rps17、rps19、rps20、rps24、rps26、rps28、rps29、rps7、rtel1、runx1、sbds、tcirg1、terc、tert、tinf2、vps45、was和wrap53。本发明的有益效果在于：本发明方案建立了一套骨髓衰竭综合征的基因组合(panel)，本发明的基因panel共计65个基因，包含了bmfs所有亚型相关基因，可以协助对骨髓衰竭综合征进行精准分型，并在一定程度上提示临床疾病预后情况。本发明方案的基因panel可以对骨髓衰竭综合征进行全面检测，其检测范围包括了骨髓衰竭综合征对应who下属所有与基因突变相关的亚型的相关基因位点，具备非常强的临床指导意义。本发明还包括上述基因组合在构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库中的应用。本发明的有益效果在于：本发明方案的基因组合实用性强，本发明涉及的65个基团，包括了目前国际上所有研究相关的骨髓衰竭综合征基因以及发明人通过临床数据分析得到的与骨髓衰竭综合征相关的基因，涉及到了疾病的分型以及治疗，其具有极强的临床意义以及科学研究意义。本发明还包括针对上述基因组合的由多对引物对组成的引物库，所述引物库中的引物能够特异性扩增上述基因组合中各基因的外显子区域或热点区域。进一步地，所述引物库包含如下表1所示的895对引物：表1。本发明的有益效果在于：所述引物库中的引物经过了大量筛选和实验验证，每对引物对应的产物长度均在100～160bp之间，且保证了各个引物的扩增效率及特异性。使用引物库中的引物对基因panel扩增的效率均一性能达到85％以上，扩增效率、扩增均一性、非特异性扩增比例等等各方面性能均经过详细评估及优化，保证了测序数据的高利用率，确保了结果的稳定性。本发明还包括一种构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：利用上述引物库中的引物获取目标dna片段构建形成所述高通量测序文库(library)。进一步地，所述高通量测序文库是通过以人基因组dna为模板，使用上述引物库进行多重pcr扩增得到的。进一步地，所述构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：s1、从外周血样本中，提取血液dna样本；s2、以上述操作提取的dna为模板、以所述引物库中引物进行多重聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)反应，得到含有目标dna片段集合的混合液。其中，多重聚合酶链式反应(多重pcr)的原理如图1所示。s3、向所述步骤s2得到的含有目标dna片段的混合液中，添加不同的高通量测序(又称二代测序，nextgenerationsequencing，ngs)标签(index)，然后两端连接含有测序所需的接头，并利用磁珠进行纯化，最终得到带测序接头的目标dna片段混合体，即高通测量序文库(library)。本发明的有益效果在于：本发明的65个基因涉及895个扩增片段，采用多重pcr的方法进行ngs文库构建，在降低了起始dna量的前提下，提供了一种快捷的建库技术(整个过程仅需7个小时)。本发明方案采用低起始量的同时能检测广泛位点：采用多重pcr法构建文库，其优点在于，相比于传统的taqman-qpcr法检测突变，多重pcr法能一次性检测几百、上千个片段及相关位点，具有传统pcr及微滴度pcr(dropletdigitalpcr，ddpcr)无法达到的通量。多重pcr法构建dna文库，仅需要最低1ng的dna起始量，与杂交捕获法构建ngsdna文库相比，该方法大大降低了dna的量的需求。在进行现有的snv、indel检测中该方法尤其适用。进一步地，所述步骤s1中采用商用的dna提取试剂盒；优选地，所述dna提取试剂盒购自qiagen；更优选地，采用qiagen生产的dna提取试剂盒结合nanodrop、qubit等仪器进行提取后dna浓度及质量监控。进一步地，所述步骤s2中，所述pcr试剂为商业购买的试剂；优选地，所述pcr试剂购自lifetech公司；更优选地，所述pcr试剂的型号为ampliseqlibrarykit。优选地，所述步骤s3中，所述index采用illumina通用index序列，且最终文库结构为测序接头i-xx-aa-测序接头ii，其中，测序接头i和测序接头ii为两端测序所需的illumina接头核苷酸序列或lifetech的测序接头序列，所述xx为不同序列的index(用于区分不同样本的dna数据)；所述aa为pcr产物。优选地，所述测序接头i的核苷酸序列为tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag(如seqidno:1所示)，所述测序接头ii的核苷酸序列为ctgtctcttatacacatctccgagcccacgagac(如seqidno:2所示)；其中，本发明方案的接头碱基序列包括并不仅限于上述序列，可以为其它illumina对应接头序列。优选地，所述aa的长度在100～160bp之间。本发明的有益效果在于：通过对构建的高通量测序文库进行测序以及数据分析，寻找到致病突变，明确疾病分型、用药或预后情况，可以为临床诊断和精准用药提供依据。本发明方案中对文库进行测序，测序仪可以采用lifetech平台配套仪器(ionpgm)。测序过程中将对各个dna片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成fastq/bam等数据文件。测序深度平均在500x左右，保证低比例突变能被有效地检测到。针对测序，本发明可以兼容多种illumina测序仪，包括从miseq、hiseq到novaseq等等。同时，针对life公司的测序仪，本发明可适用于pgm、proton、s5三个不同平台的life公司测序仪。对得到的数据进行分析的具体过程为：a)原始数据经过index拆分后，得到不同样本的原始测序数据，接着利用bwa软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库hg19参考序列上，同时筛除低于q20质量的数据。b)利用samtools及gatk等软件，对上述处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的snp及indel信息。c)利用falsefilter生信软件进行假阳性位点筛除，得到一份含有真实突变信息的文件(vcf文件)。d)利用上述获得目标片段中的基因突变(snv)及微小插入/缺失突变(indel)数据，通过annovar、clinvar、dbsnp、cosmic、hgmd等软件及数据库进行突变的解读。对数据进行分析，包括但不仅限于不同样本数据拆分、数据质量控制(q20)、snpcall、coverageanalysis等等部分，使用可以是商业化的软件或自主开发的相关软件进行分析。本发明还包括上述基因组合、引物库或采用上述方法构建的高通量测序文库在制备骨髓衰竭综合征诊断试剂或诊断试剂盒的应用。一种骨髓衰竭综合征诊断试剂或诊断试剂盒，包含上述引物库。本发明的有益效果在于：本发明方案的基因panel可以对骨髓衰竭综合征进行全面检测，其检测范围包括了骨髓衰竭综合征对应who下属所有与基因突变相关的亚型的相关基因位点，具备非常强的临床指导意义，使用引物库对基因panel扩增的效率均一性能达到85％以上，保证了测序数据的高利用率。附图说明图1为本发明实施例的两步法多重pcr原理示意图。图中，gdna经过由多对pcr引物组合而成的panel的扩增后，得到含有大量目的dna碱基片段的初始文库，通过将测序仪测序所需识别的起始接头序列1、2连接到各片段两端后，进一步通过pcr进行目标dna文库的富集，最终形成最后的文库后，即可进行测序。具体实施方式为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本发明通过检索ncbi、hgmd、omim、中国知网等等各大数据库进行基因panel信息的第一步收集。同时，对国人数据进行深度分析，通过精准临床分型以及基因通路分型进行基因归类，通过检出率以及q20等质控数据进行突变位点的数据过滤，得到一批过滤剩下后基因panel，并与第一步的基因组合进行并集处理，最终整理得到65个基因的panel。该panel涵盖了骨髓衰竭综合征分型到预后所有层面的相关基因位点(其中含多个发明人新发现的目前未报道的基因位点)，具有极强的临床指导意义。本发明实施例1为一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合，该基因组合包含如下表2所示的基因：表2基因清单该panel涵盖了骨髓衰竭综合征分型到预后所有层面的相关基因位点(其中含多个发明人新发现的目前未报道的基因位点)，具有非常强的临床指导意义。针对这65个基因的外显子区域或热点区域，以及含申请人新发现的与骨髓衰竭综合征分型、预后相关的位点的区域，进行多重pcr引物设计。通过进行引物与引物、引物与模板之间的非特异性结合概率计算来选取非特异性最低的引物组合，着重避免引物末端出现的非特异性结合情况的出现。同时，设计引物时需要考虑每对引物对应扩增产物的长度在100～160bp之间，保证设计的引物所扩增得到的最终产物能有效的进行后续的测序反应。经过实验验证和大量筛选，得到895对引物，将895对引物混合，得到引物库。本发明实施例2为一种构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：(1)样本dna的提取采用商业化的dna提取试剂盒(qiagen公司《qiaampdnabloodminikit》，货号51104)，将样本外周血提取成dna溶液，采用nonodrop测定dna260/230质量，利用qubit仪器检测dna浓度。(2)dna多重pcr文库制备将上述得到的dna样本进行建库，采用试剂盒为lifetech公司的《ampliseqlibrarykit》试剂盒。相关流程如下：a)将dna按照如下表3体系配制：表3dna反应液组分表组分反应体系(20μl)高保真pcr缓冲液45倍浓度的引物库4dna，10ngy去离子水(12-y)总体积20备注：y为15ngdna所需加入的液体体积。b)将上述加入dna的反应液放入到热循环仪中按照如下表4程序进行反应：表4反应参数表c)将2μlfupa溶液加入到上述得到的pcr反应液，混匀后放置于热循环仪中进行如下表5条件反应：表5时间梯度表温度时间50℃10min55℃10min60℃20min10℃保持(最多1小时)d)上述反应结束后，按照如下表6配方进行下一步反应液配制：表6反应液配方组分体积switch溶液4μl稀释特异性标签混合液2μldna连接酶2μl总体积(包含22μl消化的扩增子)30μle)将上述反应液放置于热循环仪中按如下表7条件进行如下反应：表7反应时间梯度表温度时间22℃30min72℃10min10℃保持(最多1小时)f)上述反应结束后，按如下步骤进行纯化：i.打开pcr管或96孔板薄膜，每孔加60μl(2x样本体积)ampurexp磁珠，移液器上下吹打5次，将dna和磁珠充分混匀。ii.混合液室温孵育5分钟。iii.将混合液放到磁力架上，静置2分钟，直到混合液变清澈。小心的去除上清，不要扰动磁珠。iv.每管加150μl新配制70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，不要扰动磁珠。v.重复上一步骤一次。vi.确保所有乙醇被除尽，pcr管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5分钟。g)待酒精完全干燥后，开pcr管或96孔板薄膜，每孔加25μl高保真platinumpcr超级混合液，1μl文库扩增引物。高保真platinumpcr超级混合液和文库扩增引物可以提前混匀。h)将混合液放置于热循环仪上，进行如下表8条件进行反应：表8反应条件表i)每管加12.5μl(0.5x样本体积)ampurexp磁珠，每管大约25μl样本。盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。j)室温孵育5分钟。k)将pcr管或96孔板放到磁力架上，至少5分钟，直到溶液澄清。l)紧接着上面步骤，每管加30μl(1.2x样本体积)ampurexp磁珠，每管大约25μl样本。盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。m)混合液室温孵育5分钟。n)将混合液放到磁力架上，静置2分钟，直到混合液变清澈。小心的去除上清，不要扰动磁珠。o)每管加150μl新配制70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，不要扰动磁珠。p)重复上一步骤一次。q)确保所有乙醇被除尽，pcr管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5分钟。r)各pcr管或96孔板每孔加25μl去核酸水溶解ampurexp磁珠，盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。s)将pcr管或96孔板放到磁力架上，至少2分钟，直到溶液澄清。小心吸取上清20μl，上清即文库，做好标记。t)将上述文库进行qubit仪器质控检测，并记录浓度。浓度低于0.2ng/μl的文库视为不合格文库。(3)文库测序将上述文库按lifetech公司的pgm测序准备流程操作并进行测序。(4)数据分析a)原始总数据经过机器拆分后，得到不同样本的原始测序数据。b)利用bwa软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库hg19参考序列上，同时筛除低于q20质量的数据。c)利用samtools对上述处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的snp及indel信息。d)利用falsefliter进行假阳性突变的过滤，生成最终的vcf文件。e)通过annovar软件进行上述snp及indel进行注释，并结合clinvar、cosmic、pubmed等数据库整理突变意义信息，结果如下表9所示：表9本发明实施例2的分析结果表样本编号q>20数据量测序reads数靶标区域覆盖度测序深度(x)均一性样本1583,540654,58897％62491％样本2719,580785,45694％74694％表9：下机样本数据质控，平均深度在500x左右，靶区域覆盖度在95％左右，文库测序均一性在93％左右，表明该检测方法能良好的对样本进行检测。综上所述，本发明提供的一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、构建高通量测序文库的方法及其应用，本发明方案能够对样本进行良好地检测，本发明方案基因panel中所选基因均具备明确的临床意义，旨在降低无效数据及模糊测序结果对疾病诊疗造成的干扰，同时还可节约整体实验成本。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>珠海铂华生物工程有限公司<120>一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>33<212>dna<213>未知(unknown)<400>1tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag33<210>2<211>34<212>dna<213>未知(unknown)<400>2ctgtctcttatacacatctccgagcccacgagac34当前第1页12