一种基于RPA检测番茄褪绿病毒的方法与流程

本发明提供一种快速、简捷的番茄褪绿病毒的检测方法，属植物保护领域。

背景技术：

番茄褪绿病毒病（tomatochlorosisvirus，tocv）是一种由烟粉虱传播的新的病毒病，暴发后在我国迅速蔓延，并逐年加重。番茄褪绿病毒病属于长线形病毒科（closteroviridae）、毛线病毒属（crinivirus）。侵染寄主植株后表现为下部叶片叶脉间慢慢褪绿或黄化，随后逐渐向上部叶片蔓延，叶脉逐渐变成深绿色，染病叶片变得厚而脆，植株长势也变弱，其病症与生理性缺素症或营养元素缺乏相似。目前，番茄褪绿病毒病已成为我国番茄生产中一种毁灭性的新病害，严重威胁着我国番茄产业未来的健康发展。

目前，检测番茄褪绿病毒病国际上主要采用rt-pcr技术，而血清学检测方法应用得较少。分子生物学检测主要是通过病毒的核酸来检测病毒，它比血清学方法的灵敏度要高，能检测到更高数量级的病毒，特异性强、操作简便、可用于大量样品检测。自pcr技术发明以来，已经成为病毒检测一种普遍采用的方法。但由于pcr技术对仪器的依赖度高，需要精密的温度循环仪器才能完成扩增过程。加之成本高、耗时长，这些局限性使其应用大多限制于条件完善的实验室内，难以广泛应用于现场检测。

近年来，恒温核酸扩增技术的出现恰可解决技术的局限，它对仪器的要求大为简化，反应时间明显缩短，因而日益受到关注。重组酶聚合酶扩增技术（rpa），即是恒温核酸扩增技术的一种，可在常温下进行反应，且反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便。目前rpa技术在医学病原物的快速诊断中得到了一些应用，农业领域中主要用于转基因作物的检测。用于植物病毒检测的报道较少，番茄褪绿病毒病是近几年番茄上最严重的病害之一，快速、准确地检测该病原对于病害防治至关重要。

技术实现要素：

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种用于检测番茄褪绿病毒的特异性引物，其特征在于所述的引物序列为

f4:5’-gatttgataaatgaggttagacccaaaatg-3’，seqidno:1

r5:5’-cgtttcttttcataagtaggttcgagataa-3’；seqidno:2。

本发明进一步公开了采用上述的特异性引物进行番茄褪绿病毒的检测方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）总rna提取及cdna的合成：将提取的rna制备成cdna，-20℃保存备用；

（2）引物设计：设计检测番茄褪绿病毒的rpa检测引物；

（3）检测：以制备的cdna为模板，利用设计的引物进行rpa扩增，同时设置阴性对照，rpa扩增体系的配制方法如下:向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入再水化缓冲液29.5μl，去离子水10μl，上、下游引物各2.5μl，终浓度为0.4μmol/l)，模板cdna3μl，最后再加入醋酸镁溶液2.5μl，280mmol/l；将rpa扩增体系充分混匀，置于39℃的金属浴上反应40min，rpa反应结束后，利用纯化试剂盒对rpa扩增产物进行回收纯化，取产物5μl于1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

本发明更进一步公开了上述方法在用于快速有效的鉴定出感染番茄褪绿病毒的植株方面的应用。实验结果显示：基于rpa检测番茄褪绿病毒的新方法更简便快捷、灵敏度更高，在实际生产和科研中能够有效节约人力和物力。

本发明主要解决了如何简便快速灵敏的检测番茄褪绿病毒的问题，重点考察了在实际生产中普遍运用的检测方法存在的不足，主要的难点在于特异性引物的设计和筛选。

本发明更加详细的描述如下：

主要步骤：

1、材料与方法

1.1材料

含番茄褪绿病毒的番茄叶片采自天津市西青区第六阜温室中（有市售），阴性对照为脱毒番茄苗（有市售），样品经pcr检测和序列测定确认后-80℃冻干保存。

1.2方法

1.2.1总rna提取及cdna的合成

参照试剂盒操作(植物总rna提取试剂盒，takara)，提取番茄叶片的总rna。参照反转录试剂盒(primescriptrt-pcrkit，takara)的操作，将提取的rna制备成cdna，-20℃保存备用。

1.2.2引物设计

参考rpa引物设计的要求，根据tocv已测序和已报道的cp基因的保守序列，设计检测番茄褪绿病毒的rpa检测引物。

表1设计的引物

表2引物组合及产物大小

1.2.3rpa检测

以1.2.1制备的cdna为模板，利用设计的引物进行rpa扩增，同时设置阴性对照(模板为脱毒番茄苗叶片cdna)。rpa扩增体系的配制方法如下:向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管(twistampbasickits，twist)中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl，去离子水10μl，上、下游引物各2.5μl(终浓度为0.4μmol/l)，模板cdna3μl，最后再加入醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)。将rpa扩增体系充分混匀，置于39℃的金属浴上反应40min。rpa反应结束后，利用纯化试剂盒（dnafragmentpurificationkit,takara）对rpa扩增产物进行回收纯化，取产物5μl于1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

从图1中可以看出感染番茄褪绿病毒的番茄叶片对应的rpa扩增产物含有1条大小为246bp的目的条带，阴性对照无条带。

1.2.4rpa检测方法特异性评价

按照1.2.3rpa检测反应体系，对供试样品包括番茄褪绿病毒共4种病毒的cdna进行检测，对所建立的rpa检测方法特异性进行评价。

从图2中可以看出仅有感染番茄褪绿病毒的番茄叶片对应的rpa扩增产物含有1条大小为246bp的目的条带，感染其它种对照病毒的番茄叶片和阴性对照均无条带，由此证明本实验的rpa引物具有高特异性。

1.2.5rpa检测方法灵敏度评价

将带毒株的总rna制备的cdna（100ng/ul）进行10倍梯度稀释，分别为10、10⁰、10^-1、10^-2、10^-3共5个稀释度，以梯度稀释的cdna为模板，按照1.2.3所示的rpa检测反应体系进行rpa灵敏度实验。从图3中可以看出，本实验方法的灵敏度为10⁰稀释度。

附图说明

图1:利用引物对t10对番茄褪绿病毒进行rpa检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中m为markerdl2000，1为感染番茄褪绿病毒叶片，2为脱毒番茄叶片；

图2:利用引物对t10对番茄褪绿病毒进行特异性筛查的琼脂糖凝胶电泳图，其中m为markerdl2000，1-5分别为番茄褪绿病毒、番茄黄化曲叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒及阴性对照的扩增产物；

图3：利用引物对t10对番茄褪绿病毒进行灵敏度筛查的琼脂糖凝胶电泳图，其中m为markerdl2000，1-6分别为番茄褪绿病毒cdna的10²、10¹、10⁰、10^-1、10^-2、10^-3稀释度的扩增产物。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

一种采用特异性引物进行番茄褪绿病毒的检测方法，按如下的步骤进行：

（1）总rna提取及cdna的合成：将提取的rna制备成cdna，-20℃保存备用；

（2）引物设计：设计检测番茄褪绿病毒的rpa检测引物；

（3）检测：以制备的cdna为模板，利用设计的引物进行rpa扩增，同时设置阴性对照，rpa扩增体系的配制方法如下:向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入再水化缓冲液29.5μl，去离子水10μl，上、下游引物各2.5μl(终浓度为0.4μmol/l)，模板cdna3μl，最后再加入醋酸镁溶液2.5μl，280mmol/l；将rpa扩增体系充分混匀，置于39℃的金属浴上反应40min，rpa反应结束后，利用纯化试剂盒对rpa扩增产物进行回收纯化，取产物5μl于1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

引物序列为：

f4:5’-gatttgataaatgaggttagacccaaaatg-3’，seqidno:1

r5:5’-cgtttcttttcataagtaggttcgagataa-3’。seqidno:2

实施例2

实际应用：

1.材料：天津市农业生物技术研究中心自育材料“206”（对外有售）

2.方法

2.1育苗

将番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待长出真叶后放入养虫笼中与白粉虱一同培养，待植株发病后采集叶片进行检测。

2.2rna提取及cdna合成。

利用rna提取试剂盒和反转录试剂盒分别进行rna提取和cdna合成。

2.3rpa检测。

引物序列为f4:5’-gatttgataaatgaggttagacccaaaatg-3’，

r5:5’-cgtttcttttcataagtaggttcgagataa-3’。

rpa总反应体系为50ul，包括rehydrationbuffer29.5μl，上、下游引物各2.5μl(终浓度为0.4μmol/l)，模板cdna3μl，去离子水10μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)。

rpa反应条件为39℃的金属浴上反应40min。

产物进行纯化后于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4结果

感病植株扩增出246bp的条带，未感病植株没有扩增出条带。证明该方法能有效鉴定出感染番茄褪绿病毒的植株。

sequencelisting

<110>天津市农业生物技术研究中心

<120>一种基于rpa检测番茄褪绿病毒的方法

<160>2

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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