一种荷叶黄酮苷的提取方法以及包括荷叶黄酮苷的药物制剂与流程

本发明属于中药提取与应用技术领域，尤其涉及一种荷叶黄酮苷的提取方法以及包括荷叶黄酮苷的药物制剂。

背景技术：

睡莲科植物莲(nelumbonuciferaeigaertn)在中国多地都有种植，以江苏、浙江、安徽等省种植广泛，既可观赏，又可食用，也可药用的植物，在医药、食品、保健品等行业都有应用。荷叶中含黄酮、生物碱、多酚、挥发油、甾类、萜类、脂肪酸、脂肪醇、蛋白质、单宁等百余种化学成分，黄酮类和生物碱类化合物是其主要的药理活性成份。黄酮类有单葡萄糖醛酸苷(槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷，q3ga)、双葡萄糖醛酸苷(槲皮素-3-o-β-d-双葡萄糖醛酸苷)，金丝桃苷(槲皮素-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷)、异槲皮苷(异槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷)和紫云英苷(莰非醇-3-o-葡萄糖苷、山柰酚-3-葡萄糖苷)等约30种，余为多酚、挥发油等。目前，荷叶供大于求，使用量较少，且荷叶在医药、食品、保健品等行业的应用还处在比较初始阶段，开发的广度与深度远不能适应时代的需求。如何开发荷叶新用途，特别是用于多发病和某些重大疾病的防治，是药学工作者的使命。

荷叶为睡莲科植物莲的干燥叶，性平味苦，无毒(小鼠的ld50＞5g/kg)，具有清解暑邪、轻宣透邪、升清降浊、醒脾开胃、止血散瘀的功效。荷叶黄酮苷用于降脂减肥、抗氧化、清除自由基、抗衰老、保肝和抑制肝纤维化、抗肝毒、抗菌消炎等，入心、肝、胆、脾、胃经。历代医书中多有记载，明代戴元礼的《秘传证治要决》中对于荷叶减肥功效记载：“荷叶服之，令人瘦劣”。《本草拾遗》中亦云：“久食令人瘦”。随着人民生活水平的提高，日摄入脂肪、糖的量日益增加，冠心病、ad症、高血脂、肥胖症患者也日渐增加，对药学研究工作者也提出了更高要求，降脂、减肥药物研发日益迫切。

给高脂血症模型大鼠、小鼠灌胃单味荷叶水提取物的降脂减肥研究，观察对血清胆固醇及甘油三脂的影响，结果显示：荷叶水能使高脂血症大鼠的tc下降25.6％～39.3％，tg下降18.9％～39.2％，对hdl-c未见明显影响，但随tc、tg的降低，低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)显著下降，同时荷叶水煎剂能降低全血比黏度、红细胞压积(％)，从而改善血液浓粘状态。荷叶黄酮对高胆固醇表现出明显的抑制作用；体外培养肝细胞合成tc实验显示：荷叶黄酮在使肝细胞内tc降低的同时又使培养液tc明显升高。其作用主要表现在促进脂类代谢方面，对其合成的抑制作用较弱。主要活性部位集中在黄酮上，动物活动正常，无明显腹泻和抑制食欲的现象发生。

近年来，许多药学工作者对荷叶中有效组分的提取、纯化及其质量、剂型、新适应症和作用机制等研究日益关注。但现有的荷叶黄酮苷提取方法，或提纯工艺较繁琐冗长，费时费事，生产成本高，或产品纯度不高，或收率较低，均不尽人意，尚无规模化生产。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取方法简单、成本低，提取收率高、获得产品纯度高的荷叶黄酮苷的提取方法及包括荷叶黄酮苷的药物组合物。

基于上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种荷叶黄酮苷的提取方法，包括以下步骤：1)将荷叶粉加60～80℃的水，进行第一次搅拌提取，第一次甩滤，获得滤液1和滤渣1；2)将所述滤渣1加60～80℃水，进行第二次搅拌提取，第二次甩滤，获得滤液2和滤渣2；3)将所述滤渣2加60～80℃水，进行第三次搅拌提取，第三次甩滤，获得滤液3和滤渣3；4)合并所述滤液1、滤液2和滤液3，放冷至25～30℃，调节ph为2-3，放置2h，经错流过滤，得精滤液；5)调节所述精滤液的ph值为5～6.5后，用大孔树脂吸附、洗涤、洗脱，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，完成荷叶黄酮苷的提取与纯化；所述荷叶黄酮苷即是槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷。

优选的，步骤1)中所述荷叶粉与水的质量比为1：(7～10)。

优选的，步骤2)中所述滤渣1和步骤3)中所述滤渣2与水的质量比独立为1：(5～8)。

优选的，步骤1)中所述第一搅拌提取的时间为12～18min。

优选的，步骤2)中所述第二搅拌提取或步骤3)中所述第三搅拌提取的时间独立为5～10min。

优选的，所述5)收集洗脱液后还包括调节所述洗脱液的ph值为1.5～3.5，用纯化水和30％乙醇洗涤，再以体积浓度50～95％的乙醇溶液洗脱实现浓缩。

本发明还提供了上述方法提取获得的荷叶黄酮苷，所述荷叶黄酮苷即为槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷的纯度≥99％。

本发明还提供了包括上述荷叶黄酮苷的药物制剂。

本发明提供的荷叶黄酮苷的提取方法，荷叶粉通过三次搅拌提取甩滤，得粗滤液放冷至室温，调ph2-3，放置2h，经错流过滤得精滤液，调节精滤液的ph为5-6.5，过大孔树脂吸附、洗涤、洗脱，得荷叶黄酮苷即槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷，其纯度高≥99％；本发明所述提取方法简便快捷，提取工艺能够实现自动化、智能化、绿色化和数字化量化，相对于其他提取需多次过树脂柱或不同填料柱分离纯化的方法，能显著节能减排，省时省事，省厂房省设备，提高收率，降低成本，产物的质量稳定可控，便于工业化生产。

进一步的，采用甩滤和错流过滤联用的方法进行过滤，提高过滤速度的同时，而且实现精密过滤。

进一步的，本发明所述提取方法通过各个步骤参数设定，实现全过程质量在线控制体系，解决了生产的产品批内均一性和批间重复性差异大的问题，从根本上保证了产品质量稳定可控。

附图说明

图1为未分离纯化的荷叶粉的hplc指纹图谱图；

图2为荷叶黄酮苷(q3ga)对照品的hplc图；

图3为实施例1中荷叶黄酮苷(q3ga)的hplc图；

图4为荷叶黄酮苷(q3ga)溶剂的hplc图；

图5为实施例4中荷叶黄酮苷(q3ga)的hplc图。

具体实施方式

本发明提供了一种荷叶黄酮苷的提取、纯化方法，包括以下步骤：1)将荷叶粉加60～80℃的水搅拌提取，第一次甩滤，得粗滤液1和滤渣1；2)将所述滤渣1加60～80℃水搅拌提取，第二次甩滤，得粗滤液2和滤渣2；3)将所述滤渣2再加60～80℃水搅拌提取，第三次甩滤，得粗滤液3和滤渣；所述滤渣可制沼气和绿肥；4)合并粗滤液1、2、3，放冷至室温，调节ph为2-3放置2-3h，经错流过滤，得精滤液，完成提取；5)调节所述精滤液的ph值为5～6.5后，用大孔树脂吸附、洗涤和洗脱，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，完成荷叶黄酮苷的纯化；所述荷叶黄酮苷即是槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷。

在本发明中，将荷叶粉与水混合进行首次搅拌提取。在本发明中，所述荷叶粉与水的质量比优选为1：(7～10)，更优选为1：(8～9)；所述首次搅拌提取的时间优选为12～18min，更优选为13～17min，最优选为15min。本发明中所述水的温度优选为60～80℃，具体可选为65～79℃、68～75℃、70～73℃、69℃、71℃或78℃；本发明中所述首次搅拌提取的料液温度优选为55～60℃。本发明对所述荷叶粉的来源和粒度没有特殊限定，通常采用荷叶中粉即可，本发明对所述水没有特殊限定，采用本领域常规提取用纯化水即可。

本发明在获得滤渣1后，加60～80℃水，进行第二次搅拌提取。在本发明中，所述滤渣1与水的质量比优选为1：(5～8)，更优选为1：(6～7)。本发明中所述第二次搅拌提取的时间优选为5～10min，更优选为6～9min，最优选为8min。本发明中所述水的温度优选为60～80℃，具体可选为65～79℃、68～75℃、70～73℃、69℃、71℃或78℃；本发明中所述第二次搅拌提取的实际温度优选为55～60℃。本发明所述第二次搅拌提取后，进行第二次过滤获得滤液2和滤渣2。

本发明在获得滤渣2后，再次加水，进行第三次搅拌提取。其渣:水之比，提取时间，水的温度，实际料液温度等主要参数与操作均与第二次提取相同。本发明所述提取中渣-液粗分离可以用甩滤或压滤，优选的是甩滤，简便快捷。

本发明对所述三次搅拌提取过程中搅拌的转速没有特殊限定，根据具体设备的可能设定，以快为好，搅拌有利活性成分的溶出。一般实验室小设备，几百转/min，对于生产设备和搅拌器的类型不同，转速多在30-60转/min之间。

本发明对所述甩滤液1-3合并后方冷至室温，调节ph为2-3，放置2h经错流过滤精滤得精滤液，甩滤是精滤的预滤，没有甩滤就无法精滤，精滤才是目标过滤。

本发明所述精滤液应调节其ph为5～6.5后，过大孔树脂吸附、梯度洗地、洗脱，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，至此，完成中药提取液的分离纯化。本发明对调节精滤液用的试剂没有特殊限定，常用的为盐酸和氢氧化钠，浓度应需要而定。在本发明中，所述大孔树脂的型号优选为fl-2、sp-3、d101或d301；所述大孔树脂柱的径高比优选为1:8～33；本发明中所述精滤液的上样流速优选为1～2bv/h，更优选为1.5bv/h。本发明在所述精滤液上样后，进行梯度洗涤、洗脱。本发明所述洗脱前，优选的还包括洗涤步骤，尤其是制备注射用原料，所述洗涤优选的为用体积分数0～12％乙醇梯度洗涤后，再以本发明中所述洗脱用溶液优选为体积浓度15～25％的乙醇水溶液洗脱后，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，至此，即完成荷叶黄酮苷的提取与分离纯化，采用本发明所述的方法经过一次大孔树脂吸附即可完成荷叶黄酮苷的分离纯化。

本发明在收集所述稀洗脱液后，优选的还包括调节所述洗脱液的ph值为1.5～3.5，优选的为2～3，用大孔树脂吸附富集，用纯化水和30％乙醇洗涤，再以体积浓度50～95％的乙醇溶液洗脱，洗脱速度与前述精滤液的大孔树脂吸附和洗脱一致，实现浓缩。

本发明在所述浓缩后，优选的还包括将浓缩获得的荷叶黄酮苷浓缩液干燥获得荷叶黄酮苷固体粉末。所述干燥优选的为减压干燥和/或负压喷雾干燥。鉴于荷叶黄酮苷在水中的溶解度很小，为“不溶级”，进一步优选的将荷叶黄酮苷浓缩液放置后过滤、收集固相组分为鲜黄色粉末状荷叶黄酮苷，滤液采用负压喷雾干燥，再得鲜黄色粉末状荷叶黄酮苷粉末，两次获得荷叶黄酮苷鲜黄色粉末，纯度未见明显差别。

本发明还提供了一种上述方法提取获得的荷叶黄酮苷，即槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷的纯度大于99.5％。

本发明还提供了上述荷叶黄酮苷的药物制剂。所述药物制剂中槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷的含量优选为25～45％。本发明对所述药物制剂的辅料和剂型没有特殊要求。在本发明具体实施过程中，所述药物制剂的辅料包括甜味剂、填充剂、缓释剂和着色剂中的一种或几种。本发明中所述药物制剂的剂型为滴丸剂、胶囊剂、微丸剂、片剂、缓释微丸剂、缓释胶囊剂和缓释片剂。本发明中所述药物制剂具有清解暑邪、轻宣透邪、升清降浊、醒脾开胃、止血散瘀等功效，入心、肝、胆、脾、胃经。用于降脂减肥、抗氧化、清除自由基、增强免疫，抗衰老、保肝和抑制肝纤维化、抗肝毒、抗菌消炎等，为肝病和脑卒中患者的临床治疗提供一种新的选择。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1荷叶黄酮苷/槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷的制备

提取取荷叶粉100g，置2000ml三颈瓶中，加80℃水800ml，搅拌20min，趁热过滤，压紧抽干，取滤渣加80℃水600ml，搅拌10分钟min，趁热过滤，压紧抽干，再取滤渣加80℃水600ml，搅拌10min，趁热过滤，压紧抽干。合并三次滤液，放冷至室温，调ph为2.6，放置2h，精密过滤，取精滤液调ph为5.5。

分离纯化取ph为5.5的精滤液，以1.5bv/h流速过fl-2大孔树脂柱，树脂柱径高比为1:26，随后用0-12％乙醇，以1.5bv/h流速梯度洗涤，再以体积浓度15％-25％乙醇洗脱。至此，仅一次过大孔树脂柱即完成纯化。

富集取ph为2-3稀洗脱液过sp-3大孔树脂富集，用纯化水和30％乙醇洗涤，再以体积浓度50～95％的乙醇溶液洗脱，收集产品浓缩液。

干燥鉴于荷叶黄酮苷在水中的溶解度很小，为不溶级，浓洗脱液放置后约有40％q3ga析出，可减压蒸馏至干，即得鲜黄色粉末状q3ga，hplc图见图3，纯度为99.51％，重1.39g，收率为69.50％。

实施例2荷叶黄酮苷/槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷的制备

提取取荷叶粉20kg，置提取罐中，加80℃热水160kg，搅拌20min，趁热甩滤，取滤渣加80℃水120kg，搅拌10分钟min，趁热甩滤，再取滤渣加80℃水120kg，搅拌10min，趁热甩滤。合并三次甩滤液，放冷至室温，调ph为2.6，放置2h，错流过滤，得精滤液，调精滤液ph为5.5。

分离纯化取ph为5.5的精滤液，以1.5bv/h流速过fl-2大孔树脂柱，树脂柱径高比为1:8，随后用0-12％乙醇，以1.5bv/h流速梯度洗涤，以15％-25％乙醇洗脱。至此，仅一次过大孔树脂柱即完成分离纯化。

富集取ph为2-3稀洗脱液过sp-3大孔树脂富集，用纯化水和30％乙醇洗涤，再以体积浓度50～95％的乙醇溶液洗脱，收集产品浓溶液，放置后有较多的鲜黄色沉淀，过滤，得鲜黄色粉末状产品ⅰ和鲜黄色滤液，产品ⅰ纯度为99.48％(归一化)。

干燥取鲜黄色滤液用负压喷雾干燥器干燥，即得鲜黄色粉末状荷叶黄酮苷(q3ga)ⅱ，纯度为99.46％(归一化)，合并产品ⅰ和ⅱ，干燥，纯度99.48％，重284.73g，收率71.18％。

实施例3荷叶黄酮苷/槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷的制备

提取取荷叶粉30kg，置提取罐中，加80℃热水240kg，搅拌20min，趁热甩滤，取滤渣加80℃水180kg，搅拌10分钟min，趁热甩滤，再取滤渣加80℃水180kg，搅拌10min，趁热甩滤。合并三次滤液，放冷至室温，调ph为2.6，放置2h，精密过滤，取精滤液调ph为5.5。

分离纯化取ph为5.5的精滤液，以1.5bv/h流速过fl-2大孔树脂柱，树脂柱径高比为1:8，随后用0-12％乙醇，以1.5bv/h流速梯度洗涤，以15％-25％乙醇洗脱。一次过大孔树脂柱完成纯化。

富集取ph为2-3稀洗脱液过sp-3大孔树脂富集用纯化水和30％乙醇洗涤，再以体积浓度50～95％的乙醇溶液洗脱，收集产品浓缩液，放置后有较多的鲜黄色沉淀，过滤，得鲜黄色粉末状产品ⅰ和鲜黄色滤液。

干燥取产品ⅰ的滤液用负压喷雾干燥器干燥，即得鲜黄色粉末状产品ⅱ，合并ⅰ和ⅱ，干燥，纯度为99.68％，重441.25g，收率73.54％。

实施例4荷叶黄酮苷/槲皮素-3-o-β-d葡萄糖醛酸苷的制备

提取取荷叶粉40kg，置提取罐中，加80℃热水320kg，搅拌20min，趁热甩滤，取滤渣加80℃水240kg，搅拌10分钟min，趁热甩滤，再取滤渣加80℃水240kg，搅拌10min，趁热甩滤。合并三次滤液，放冷至室温，调ph为2.6，放置2h，精密过滤，取精滤液调ph为5.5。

分离纯化取ph为5.5的精滤液，以1.5bv/h流速过fl-2大孔树脂柱，树脂柱径高比为1:8，随后用0-12％乙醇，以1.5bv/h流速梯度洗涤，再以15％-25％乙醇洗脱，一次过大孔树脂柱完成纯化。

富集取ph为2-3稀洗脱液过sp-3大孔树脂富集，用纯化水和30％乙醇洗涤，再以体积浓度50～95％的乙醇溶液洗脱，收集产品浓缩液，放置后有较多的鲜黄色沉淀，过滤，得鲜黄色粉末状产品ⅰ和鲜黄色滤液。

干燥取产品ⅰ的滤液用负压喷雾干燥，即得鲜黄色粉末状产品ⅱ，合并ⅰ和ⅱ，干燥，hplc图见图5，纯度为99.59％，重588.94g，收率73.62％。

实施例5荷叶黄酮苷微丸

丸心处方

包衣液处方

工艺过程

预处理分别取荷叶黄酮苷、羧甲淀粉钠、微晶纤维素过80目筛。

制软材将荷叶黄酮苷、羧甲淀粉钠、微晶纤维素按等量递增的原则，将原辅料混合均匀，加入纯化水，反复搓揉制成软材。

挤压与滚圆将软材通过挤压机挤压成条，再经过切割滚圆机切割滚圆，即成湿微丸。

干燥将湿微丸置真空干燥箱中于40℃以下真空干燥，去除细粉，即得微丸。

包衣取微丸包胃溶薄膜衣，增重2.53％。

全检取样按临床研究用质量标准全检，各检测指标应均符合规定。

实施例5荷叶黄酮苷缓释微丸

荷叶黄酮苷缓控释微丸的制备

处方1正常溶出微丸的制备

丸心处方1

包衣液处方1

工艺过程

预处理取淀粉、预胶化淀粉、羧甲淀粉钠(内加2.5g)、微晶纤维素按照等量递增的原则混匀成辅料混合物；取荷叶黄酮苷、pvpk12过120目筛并混匀。用适量75％乙醇使溶解成溶液。

制软材将荷叶黄酮苷与pvpk12的75％乙醇液加到辅料混合物中，边加边混合，加完后，反复搓揉制成软材。

挤压与滚圆将软材通过挤压机挤压成条，再经过切割滚圆机切割滚圆，即成湿微丸。

干燥将湿微丸置真空干燥箱中于40℃以下真空干燥，去除细粉，即得微丸。

包衣取微丸包绿色胃溶薄膜衣。即得正常溶出的微丸。

全检取样按临床研究用质量标准全检，各检测指标应均符合规定。

处方2缓释6h微丸的制备

丸心处方2

包衣液处方2

工艺过程

原辅料预处理取乳糖、环拉酸钠、羟丙甲纤维素、卡波姆分别过80目筛并混合均匀，得辅料混合物；将荷叶黄酮苷、聚维酮k12过100目筛并混匀，用适量75％乙醇使溶解成溶液，备用。

制软材取荷叶黄酮苷、聚维酮k12的75％乙醇液加到辅料混合物中，边加边混合，加完后，反复搓揉制成软材。

挤压与滚圆将上述软材通过挤压机挤压成条，再经切割滚圆机切割滚圆。即得湿微丸

干燥将制成的湿微丸置真空干燥箱中，于40℃以下真空干燥(约40分钟)，去除细粉，即得。

包衣取微丸包黄色丙烯酸树脂ⅳ薄膜衣，即得缓释6h微丸。

全检取样按临床研究用质量标准全检，各检测指标应符合规定。

处方3缓释12h的微丸

丸心处方3

包衣液处方3

工艺过程

原辅料预处理取羟丙甲纤维素k100mcr(hpmck100mcr)过80目筛，备

用；取荷叶黄酮苷、聚维酮k12过100目筛并混匀，用适量75％乙醇溶解制成溶液，备用。

制软材将荷叶黄酮苷、聚维酮k12的75％乙醇液加到羟丙甲纤维素中，边加边混合，加完后，反复搓揉制成软材。

挤压滚圆通过挤压机挤压成条、再经切割滚圆机切割滚圆，即得湿微丸。

干燥将上述湿微丸置真空干燥箱中，在40℃以下干燥(约40分钟)，除去细粉，即得。

包衣取微丸包红色丙烯酸树脂ⅰ薄膜衣，即得缓释12h微丸。

全检取样按临床研究用质量标准全检，各检测指标应均符合规定。

荷叶黄酮苷缓控释微丸胶囊

混丸分别称取处方1、2、3微丸160g、240g、250g，或按三种微丸的溶出和释放值调整成需要的溶出-释放曲线的各微丸重量，并充分混匀。

装胶囊取混合微丸装于适宜型号胶囊壳内，即得缓释12h微丸。

分装与包装分装，贴标签、包装、入库。

全检取样按临床研究用质量标准全检，各项指标均应符合规定。

本发明所述药物组合物的临床应用主要用于肝病(脂肪肝和肝癌)和脑卒中的预防和治疗，为临床用药提供一种新选择。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。