马蔺叶肉原生质体及其制备方法与流程

本发明属于细胞生物学及生物
技术领域：
，具体涉及马蔺叶肉原生质体及其制备方法。
背景技术：
：植物原生质体因其没有细胞壁的特点，相对于组织、器官或个体水平具有独特的有点：首先原生体可以摆脱细胞骨架束缚和细胞间的相互影响，可以单独研究一个细胞的功能和全能性；其次，原生质体是一个均一性好的“细胞”群体，可以在短时间内获得大量一致性的研究对象。同时，原生质体可用于不同层次的细胞学及分子生物学研究，原生质体一个理想的单细胞系统可以来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究，也可用于细胞培养、原生质体融合、原生质体遗传转化等的新材料的创制。近年来，植物原生质体技术得到了迅速的发展，主要表现在通过原生质体获得再生植株和建立遗传转化体系的植物种类不断增加，包括粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、果树等。马蔺(irislacteavar.chinensis)，别名马莲、马兰，是鸢尾科鸢尾属多年生宿根密丛草本植物，其是鸢尾科植物中研究最多、应用最为广泛的一种鸢尾类观赏植物，而且为我国所独有，具有许多优点和重要的应用价值。马蔺的花、种子、根均可入药。马蔺不仅具有重要的药用价值，而且由于其根系发达，绿期长，花色艳丽，花期较长，绿地建植后极少需要人工管理，具有抗旱、抗寒、耐贫瘠、耐盐碱等特性，近年来已被用作缺水城市绿化、护坡固沙、盐碱地改良、园林绿化和植被恢复的优质材料。同时马蔺作为一种典型的观赏类型盐生植物，其根系发达，通过根细胞选择吸收及选择运输盐分，既拒绝吸收过量的有害盐离子，又限制将其运输到叶片等重要部位。其作为纤维植物，可以代替麻生产纸、绳，叶是编制工艺品的原料，根还可以制作刷子，其独特的生态生物学特性和利用价值，决定了其随着城市绿化及园林建设向以生态和谐环境友好型转变，作为城市街道绿化、公共绿地种植的作用和前景是不可估量的。因此，为了更好地开发和利用马蔺生态功能和遗传资源，通过将传统育种手段与现代分子生物学相结合改良和培育新的抗逆强的马蔺种质资源将其使更多的园艺性状得以充分利用，特别是基因工程技术，为其性状改良提供了全新的思路，使人们能够定向操作某个或某些目标性状成为可能。作为纤维植物的马蔺，本身组织高效再生就是一个限制问题，又因其用实生苗繁殖，后代群体基因杂合度高，因而导致建立马蔺高效的遗传转化体系一直是马蔺生物学研究的技术瓶颈。由于游离的原生质体无植物细胞壁的阻隔，其质膜经处理可直接摄取外源物质(如细胞器、病毒、dna等)，常作为遗传转化的理想受体系统，因而尝试通过原生体途径获得马蔺遗传转化体系是较为理想的选择，能克服马蔺难以遗传转化的技术瓶颈，快速建立马蔺原生体遗传转化技术，实现瞬时验证目标基因的功能，但建立这一技术体系的前提条件是获得大量高质量马蔺原生质体。但目前关于马蔺原生质体分离研究尚未有报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高效的马蔺原生质体制备方法，为突破马蔺单细胞难以分离以及难以实施马蔺遗传转化的技术瓶颈，建立了一种有效获得马蔺原生体的技术体系，为马蔺原生质体遗传转化、原生质体培养、融合等提供技术支撑。为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种马蔺叶肉原生质体的制备方法，包括如下步骤：(1)选取适宜苗龄的马蔺叶片作为处理材料，冲洗干净后在超净工作台上消毒，并用无菌水冲洗干净待用；(2)将步骤(1)洗净的马蔺叶片切成细叶丝；(3)将步骤(2)得到的细叶丝放入无菌质壁分离液中，避光处理；(4)将步骤(3)经过质壁分离处理的细叶丝放入无菌酶解液中，密封避光酶解，当酶解液变绿时置于恒温摇床上震荡，促使原生质体释放出来；(5)在步骤(4)酶解处理的叶丝溶液中，按照1:1体积加入等量的细胞等渗液，摇匀后采用细胞筛进行过滤，除去未解离组织；收集滤液并离心，弃上清液收集原生质体沉淀，然后用细胞等渗液悬浮原生质体，通过显微镜观察原生质体形态，收集完整无破碎且叶绿体分布均匀的原生质体。优选地，步骤(1)中，所选取的马蔺叶片苗龄为30～60d。所述消毒的方式为70vt％无水乙醇消毒1min，然后5wt％次氯酸钠再消毒10-15min，消除病原菌及环境微生物对原生体分离的影响。优选地，步骤(2)中，所述细叶丝的宽度为1～2mm。步骤(3)中，所述质壁分离液组成为：细胞-原生质体清洗液+130g/l山梨醇+0.6g/l吗啉乙磺酸，调节ph＝5.6～6.0；所述细叶丝与质壁分离液比例为1g:30ml；避光处理2～3h，进行质壁分离，使细胞骨架暴露易于酶解。步骤(4)中，所述酶解液组成为：细胞-原生质体清洗液+90g/l山梨醇+60g/l纤维素酶r-10+4g/l离析酶r-10+4g/l果胶酶y-23+0.6g/l吗啉乙磺酸，调节ph＝5.6～6.0。优选地，所述细叶丝与酶解液比例为1g:20ml，酶解温度22～28℃，酶解时间8～12h；所述恒温摇床的温度为22～28℃，转速为50rpm，震荡时间为30～60min。通过酶解，消除细胞壁束缚，易于原生体游离出来。步骤(5)中，所述细胞等渗液组成为：细胞-原生质体清洗液+90g/l山梨醇+0.6g/l吗啉乙磺酸，调节ph＝5.6～6.0。采用等渗液处理维持细胞等渗状态，防止原生体破碎。优选地，所述细胞筛为300目；离心转速为800rpm，4℃下离心5min，离心过程中，加速与减速均调至0档。采用低速离心减少外界环境对原生体的损伤，保证其维持细胞活力。上述制备方法制备得到的马蔺叶肉原生质体也在本发明的保护范围之内。有益效果：本发明通过对马蔺幼叶片的切丝处理和质壁分离处理，在等渗溶液中用纤维素酶、离析酶和果胶酶组合来酶解马蔺叶肉细胞壁，有效实现了马蔺叶肉原生质体的高效游离，克服了纤维素含量高鸢尾类观赏植物原生质体难以游离的技术瓶颈，建立了一种高效制备马蔺叶肉原生质体的方法。在此基础上可以进行相关细胞工程技术操作，建立马蔺原生质体培养、原生体融合、目标基因瞬时表及原生质体遗传转化等技术体系，对马蔺细胞生物学及分子生物学研究、马蔺新种质创制和新品种培育具有重要意义。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。图1为本发明马蔺原生质体的制备过程图；a.45d苗龄马蔺植株生长状态；b.45d苗龄马蔺叶片经3h避光处理和12h酶解处理获得的马蔺原生质体(bar＝10μm)。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。以下实施例中，所使用的试剂组成如下：细胞-原生质体清洗液(cpw)溶液配方：kh2po427.2mg/l；kno3101.0mg/l；cacl2·2h2o1480.0mg/l；mgso4·7h2o246.0mg/l；cuso4·5h2o0.025mg/l，加ddh2o至1l，调ph为5.6～6.0，用0.22μl的滤头过滤灭菌，滤液4℃保存备用。质壁分离液配方：cpw溶液+130g/l山梨醇+0.6g/l吗啉乙磺酸(mes)，ph为5.6～6.0；质壁分离液的配制：称取2.6g山梨醇和0.012g吗啉乙磺酸(mes)溶于20mlcpw溶液中配制质壁分离处理液，ph为5.6～6.0，用0.22μl的滤头过滤灭菌，滤液4℃保存备用。等渗液配方：cpw溶液+90g/l山梨醇+0.6g/l吗啉乙磺酸(mes)，ph5.6～6.0；等渗液的配制：称取4.5g山梨醇和0.03gmes溶于50mlcpw溶液中配制等渗液，ph为5.6～6.0，用0.22μl的滤头过滤灭菌，滤液4℃保存备用。酶解液的配制：以cpw溶液为基础，分别在其中加入纤维素酶r-10(cellulaser10)、离析酶r-10(mecerozymer10)、果胶酶y-23(pectolyasey-23)、山梨醇(sorbitol)和吗啉乙磺酸(mes)，然后混匀，调ph为5.6～6.0，55℃水浴加热10min；冷却至室温后用0.22μl的滤头过滤灭菌，滤液4℃保存备用。各组分在酶解液中的浓度如下：山梨醇为90g/l，纤维素酶r-10为60g/l，离析酶r-10为4g/l，果胶酶y-23为4g/l，mes为0.6g/l。其中，所用纤维素酶、离析酶和果胶酶均来自日本yakult公司生产的原装产品。实施例1(1)选取生长健壮苗龄为30、45、60d的马蔺幼叶作为处理材料，用自来水冲洗后放入超净工作台，70vt％无水乙醇消毒1min，5wt％次氯酸钠消毒10-15min，无菌水冲洗干净待用；(2)将步骤(1)得到的材料，在超净工作台内，放在无菌干燥的滤纸上，用无菌的剪刀或手术刀沿叶脉方向，将叶片切成1～2mm宽的细叶丝；(3)在超净工作台内，将切好的细叶丝按1g:30ml比例放入含有无菌质壁分离液的烧杯中，然后用无菌的铝箔纸包裹烧杯，避光进行质壁分离处理2h；(4)分别取上述经过质壁分离处理的细叶丝，放入预先配好的装有20ml酶解液的烧杯中，然后静置于22～28℃环境中，避光酶解8h，当酶解液变绿时置于22～28℃恒温摇床上，转速为50rpm，震荡时间为30～60min，促使原生质体释放出来；(5)将上述经过酶解的细叶丝溶液，加入等体积的等渗液，用300目细胞筛过滤，去除未解离组织，然后将滤液4℃、800rpm，加速(accel)与减速(decel)均调至0档，离心5min，去上清液，用等体积的等渗液重悬原生质体沉淀。取少量原生质体重悬液，用显微镜观察原生质体形态，并用血球计数板计数(见表1)，收集完整无破碎且叶绿体分布均匀的原生质体，4℃保存备用。表1不同苗龄马蔺幼叶分离原生质体的产率苗龄质壁分离时间酶解时间原生质体产率(×106个/g)30d2h8h5.8245d2h8h6.5060d2h8h5.32实施例2(1)选取生长健壮苗龄为30、45、60d的马蔺幼叶作为处理材料，用自来水冲洗后放入超净工作台，70vt％无水乙醇消毒1min，5wt％次氯酸钠消毒10-15min，无菌水冲洗干净待用；(2)将步骤(1)得到的材料，在超净工作台内，放在无菌干燥的滤纸上，用无菌的剪刀或手术刀沿叶脉方向，将叶片切成1～2mm宽的细叶丝；(3)在超净工作台内，将切好的细叶丝按1g:30ml比例放入含有无菌质壁分离液的烧杯中，然后用无菌的铝箔纸包裹烧杯，避光进行质壁分离处理2h；(4)分别取上述经过质壁分离处理的细叶丝，放入预先配好的装有20ml酶解液的烧杯中，然后静置于22～28℃环境中，避光酶解12h，当酶解液变绿时置于22～28℃恒温摇床上，转速为50rpm，震荡时间为30～60min，促使原生质体释放出来；(5)将上述经过酶解的细叶丝溶液，加入等体积的等渗液，用300目细胞筛过滤，去除未解离组织，然后将滤液4℃、800rpm，加速(accel)与减速(decel)均调至0档，离心5min，去上清液，用等体积的等渗液重悬原生质体沉淀。取少量原生质体重悬液，用显微镜观察原生质体形态，并用血球计数板计数(见表2)，收集完整无破碎且叶绿体分布均匀的原生质体，4℃保存备用。表2不同苗龄马蔺幼叶分离原生质体的产率苗龄质壁分离时间酶解时间原生质体产率(×106个/g)30d2h12h7.1045d2h12h8.3160d2h12h6.97实施例3(1)选取生长健壮苗龄为30、45、60d的马蔺幼叶作为处理材料，用自来水冲洗后放入超净工作台，70vt％无水乙醇消毒1min，5wt％次氯酸钠消毒10-15min，无菌水冲洗干净待用；(2)将步骤(1)得到的材料，在超净工作台内，放在无菌干燥的滤纸上，用无菌的剪刀或手术刀沿叶脉方向，将叶片切成1～2mm宽的细叶丝；(3)在超净工作台内，将切好的细叶丝按1g:30ml比例放入含有无菌质壁分离液的烧杯中，然后用无菌的铝箔纸包裹烧杯，避光进行质壁分离处理3h；(4)分别取上述经过质壁分离处理的细叶丝，放入预先配好的装有20ml酶解液的烧杯中，然后静置于22～28℃环境中，避光酶解8h，当酶解液变绿时置于22～28℃恒温摇床上，转速为50rpm，震荡时间为30～60min，促使原生质体释放出来；(5)将上述经过酶解的细叶丝溶液，加入等体积的等渗液，用300目细胞筛过滤，去除未解离组织，然后将滤液4℃、800rpm，加速(accel)与减速(decel)均调至0档，离心5min，去上清液，用等体积的等渗液重悬原生质体沉淀。取少量原生质体重悬液，用显微镜观察原生质体形态，并用血球计数板计数(见表3)，收集完整无破碎且叶绿体分布均匀的原生质体，4℃保存备用。表3不同苗龄马蔺幼叶分离原生质体的产率苗龄质壁分离时间酶解时间原生质体产率(×106个/g)30d3h8h5.8145d3h8h7.0360d3h8h5.69实施例4(1)选取生长健壮苗龄为30、45、60d的马蔺幼叶作为处理材料，用自来水冲洗后放入超净工作台，70vt％无水乙醇消毒1min，5wt％次氯酸钠消毒10-15min，无菌水冲洗干净待用；(2)将步骤(1)得到的材料，在超净工作台内，放在无菌干燥的滤纸上，用无菌的剪刀或手术刀沿叶脉方向，将叶片切成1～2mm宽的细叶丝；(3)在超净工作台内，将切好的细叶丝按1g:30ml比例放入含有无菌质壁分离液的烧杯中，然后用无菌的铝箔纸包裹烧杯，避光进行质壁分离处理3h；(4)分别取上述经过质壁分离处理的细叶丝，放入预先配好的装有20ml酶解液的烧杯中，然后静置于22～28℃环境中，避光酶解12h，当酶解液变绿时置于22～28℃恒温摇床上，转速为50rpm，震荡时间为30～60min，促使原生质体释放出来；(5)将上述经过酶解的细叶丝溶液，加入等体积的等渗液，用300目细胞筛过滤，去除未解离组织，然后将滤液4℃、800rpm，加速(accel)与减速(decel)均调至0档，离心5min，去上清液，用等体积的等渗液重悬原生质体沉淀。取少量原生质体重悬液，用显微镜观察原生质体形态，并用血球计数板计数(见表4)，收集完整无破碎且叶绿体分布均匀的原生质体，4℃保存备用。表4不同苗龄马蔺幼叶分离原生质体的产率苗龄质壁分离时间酶解时间原生质体产率(×106个/g)30d3h12h7.8245d3h12h8.3360d3h12h7.32通过以上试验实施数据，表明45d苗龄的马蔺幼苗叶片经过切丝，避光质壁分离3h，酶解12h后，获得原生质体产率最佳。依据优选方案实施，可见获得的马蔺叶肉原生质体悬浮液中，原生质体形态饱满，叶绿体分布均匀，且原生质体碎片少(见图1)，说明此条件下能获得具有较高活力的马蔺原生，为基于此技术的马蔺原生质体培养、原生质体融合、原生体遗传转化、基因瞬时表达研究等提供了技术支撑。本发明提供了一种马蔺叶肉原生质体及其制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。当前第1页12