本发明涉及一种丹参亚铁多糖的制备方法及其应用。
背景技术：
天然产物中的多糖作为近年来的研究热点之一，参与了细胞的多种生命现象的调节。目前在国际国内市场上，有抗病毒药等作用及具延缓衰老作用的天然植物多糖提取物，均具有巨大的应用价值和广阔的市场前景。而中药丹参是我国传统的珍贵中药材，其医疗用途广，发展潜力大，面临中药现代化的巨大机遇和挑战，应进一步加强其资源的利用和开发。铁是生物体所必需的微量元素之一，发挥着至关重要的作用。是体内运输氧的主要载体，铁被小肠粘膜细胞吸收，其吸收部位主要是十二指肠和空肠上段。食物中的铁分为血红素铁和非血红素铁两种，其吸收机制不同，膳食中85％以上的铁都是以非血红素铁的形式存在，并基本上由三价的铁盐组成，必须在胃中经过胃酸的作用使之游离，并还原成二价铁后才能被肠粘膜吸收。国外也有多糖铁是以多糖为配体，与三价铁结合形成的多糖铁配合物的研究报道，但由于铁的吸收机理，故不能得到好的结果。
技术实现要素：
针对现有多糖铁的现状，本发明的目的在于提供一种丹参亚铁多糖的制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种丹参亚铁多糖的制备方法，包括，在水杨酸的作用下，亚铁盐与丹参多糖反应，得到所述的丹参亚铁多糖。
优选地，所述亚铁盐为氯化亚铁、硫酸亚铁或硝酸亚铁。
亚铁盐与丹参多糖的反应可在水和/或乙醇等常用的溶剂中进行，为简化产物丹参亚铁多糖的分离操作，所述亚铁盐与丹参多糖的反应优选在乙醇溶剂中进行，所述亚铁盐为氯化亚铁，利用丹参亚铁多糖难溶于乙醇的特点，使反应生成的丹参亚铁多糖沉淀析出，从而较为方便地与溶于乙醇的氯化亚铁和丹参多糖分离开来。
为避免空气中的氧气氧化亚铁离子，反应可在惰性气氛下进行，如氮气气氛、氦气气氛、氩气气氛等。
优选地，所述丹参多糖与亚铁盐的质量比为1∶1～5∶1，更优选地，所述丹参多糖与亚铁盐的质量比为4∶1。
优选地，所述反应的温度为25～65℃，时间为20～100min，反应体系的ph值为3～7。
更优选地，所述反应的温度为45℃，时间为60min，反应体系的ph值为4。
优选地，所述水杨酸的用量为丹参多糖质量的10～50％，优选地，所述水杨酸的用量为丹参多糖质量的15～20％。
与现有补铁剂相比，本发明方法所得的丹参亚铁多糖产品口感好，吸收率高，无铁锈味，无胃肠道刺激，不易分解，且补铁、增强机体免疫力之功效比通常补铁剂好，可开发成动物饲料添加剂。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.1试药
丹参多糖：含量90％，西安万方生物科技有限公司；氯化亚铁：含量98.0％，西安鑫宝佳业化工有限公司，其余试剂均为化学纯试剂。
1.2方法与结果
1.2.1丹参亚铁多糖的制备：
准确称取丹参多糖，置于200ml锥形瓶中，将100ml的95％(m/v)乙醇加入，搅拌溶解后，加入50ml的1.0％(m/v)的水杨酸乙醇溶液，然后加入氯化亚铁，用10％的naoh或hcl溶液调ph值，充氮气，在120r/min搅拌下缓慢升温至所需设定反应温度，继续搅拌反应至设定时间，停止反应。冷却后将反应液在4000r/min下离心20min，得到沉淀，抽滤，收集滤渣，并用乙醇(3×10ml)复洗涤后，抽滤，最后真空干燥得丹参亚铁多糖。测定铁含量，以上试验重复三次，取算术平均值，以铁鳌合率和丹参亚铁多糖得率为测试指标。
1.2.2铁含量的测定：邻菲罗琳比色法
(1)铁标准溶液的配制：准确称取0.0498g硫酸亚铁溶于100ml水中，加入5ml浓h2so4，微热溶解后滴加2.0％的kmno4溶液，至最后一滴红色不褪为止，用水稀释至1000ml，摇匀。
(2)标准曲线的绘制：吸取10μg/ml铁的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，分别置于50ml容量瓶中，加入，1mol/l的hci溶液1ml，10％的盐酸羟胺1ml，0.12％邻菲罗琳1ml，然后加入10％醋酸钠，5ml，用水稀释至刻度，摇匀，以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。
(3)样品测定：准确称取0.05g的样品置于100ml烧杯中，加入2ml浓盐酸，待样品完全溶解后，用蒸馏水定容至100ml容量瓶，准确吸取5ml样品液于50ml容量瓶中，按照标准曲线的操作步骤测定吸光度。
铁的含量(mg/kg)＝c/m×v1/v0
式中c：从标准曲线上查得样品试液相应的铁含量(μg)；
m：样品的质量(g)
v1：测定时所取样品试液的体积(ml)
v0：样品处理后的定容体积(ml)
铁鳌合率的测定
铁鳌合率％＝m1/m0×％
式中m1：丹参亚铁多糖中铁的量(mg)
m0：亚铁盐原料中铁的量(mg)
丹参亚铁多糖得率的测定
丹参亚铁多糖得率＝w1/w0×％
式中w1：丹参亚铁多糖的重量(mg)
w0：丹参多糖与亚铁盐原料总重量(mg)。
1.2.3合成工艺优化
1.2.3.1ph值对鳌合反应效果的影响
准确称取3.0g丹参多糖于200ml锥形瓶中，将100ml的95％(m/v)乙醇加入，搅拌溶解后，加入50ml的1.0％的水杨酸，然后加入1.0g氯化亚铁(多糖与铁的质量比为4∶1)，用10％的naoh或hcl溶液调ph值至3、4、5、6、7，充氮气，在120r/min搅拌下缓慢升温至45℃，继续搅拌反应60min，停止反应。冷却后将反应液在4000r/min下离心20min，得到沉淀，抽滤，收集滤渣，并用乙醇(3×10ml)复洗涤后，抽滤，最后真空干燥得丹参亚铁多糖。
表1-1ph值对收率的影响
由表1-1可知，随着ph值的升高，铁鳌合率和丹参亚铁多糖得率均先增加后降低，当ph值为4时，二者均达到最大值。这是因为在ph较低的酸性条件下，h+将与金属离子竞相争夺供电子基团，从而不利于金属鳌合物的形成；随着ph的升高，意味着溶液中oh-增加，游离铁离子与oh-结合形成亲合fe2+(氢氧化亚铁)的机会增加，也不利于鳌合铁盐的生成。因此，可确定鳌合反应的较适ph值为4。
1.2.3.2丹参多糖与亚铁盐质量比对鳌合反应效果的影响
准确称取3.0g丹参多糖于200ml锥形瓶中，将100ml的95％(m/v)乙醇加入，搅拌溶解后，加入50ml的1.0％的水杨酸，然后加入设定质量比加入氯化亚铁，用10％的naoh或hcl溶液调ph值至4，充氮气，在120r/min搅拌下缓慢升温至45℃，继续搅拌反应60min，停止反应。冷却后将反应液在4000r/min下离心20min，得到沉淀，抽滤，收集滤渣，并用乙醇(3×10ml)复洗涤后，抽滤，最后真空干燥得丹参亚铁多糖。
表1-2丹参多糖与亚铁盐质量比对收率的影响
丹参多糖与亚铁盐的质量比是影响鳌合反应的一个重要因素，质量比太小，不能形成稳定的环状结构，鳌合物不稳定；质量比太大，会造成多糖的浪费。从表1-2可看出，随着丹参多糖与亚铁盐质量比的增加，铁鳌合率和丹参亚铁多糖得率均先增加后降低。因此，可初步确定丹参多糖与亚铁盐的较适质量比为4∶1。
1.2.3.3丹参多糖与水杨酸用量比对鳌合反应效果的影响
分别准确称取不同量的丹参多糖于200ml锥形瓶中，将100ml的95％(m/v)乙醇加入，配制成浓度为1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％(m/v)的溶液，搅拌溶解后，加入50ml的1.0％的水杨酸，然后按丹参多糖与氯化亚铁的质量比为4∶1加入氯化亚铁，用10％的naoh或hcl溶液分别调ph值至4，充氮气，在120r/min搅拌下缓慢升温至所需设定反应45℃，继续搅拌反应至设定时间60min，停止反应。冷却后将反应液在4000r/min下离心20min，上清液用无水乙醇处理得到沉淀，抽滤，收集滤渣，并反复洗涤抽滤2～3次，最后真空干燥得丹参亚铁多糖。
表1-3丹参多糖溶液浓度对收率的影响
由表1-3可知，随着丹参多糖与水杨酸用量比的升高，铁鳌合率和丹参亚铁多糖得率均先升高后降低，但在丹参多糖与水杨酸用量比为2∶1-10∶1的范围内对铁鳌合率和丹参亚铁多糖得率的影响并不太显著，丹参多糖与水杨酸较合适的质量比为6∶1。
1.2.3.4温度对鳌合反应效果的影响
准确称取3.0g丹参多糖于200ml锥形瓶中，将100ml的95％(m/v)乙醇加入，搅拌溶解后，加入50ml的1.0％的水杨酸，然后按丹参多糖与氯化亚铁的质量比为4∶1加入氯化亚铁，用10％的naoh或hcl溶液调ph值至4，充氮气，在120r/min搅拌下缓慢升温至设定反应温度，继续搅拌反应60min，停止反应。冷却后将反应液在4000r/min下离心20min，得到沉淀，抽滤，收集滤渣，并用乙醇(3×10ml)复洗涤后，抽滤，最后真空干燥得丹参亚铁多糖。
表1-4反应温度对收率的影响
从表1-4可以看出，不同温度条件下，铁鳌合率和丹参亚铁多糖得率不同，说明反应温度对鳌合反应效果的影响较大，多糖与铁的鳌合反应在45℃条件下得率最高。
1.2.3.5反应时间对鳌合反应效果的影响
准确称取3.0g丹参多糖于200ml锥形瓶中，将100ml的95％(m/v)乙醇加入，搅拌溶解后，加入50ml的1.0％的水杨酸，然后按丹参多糖与氯化亚铁的质量比为4∶1加入氯化亚铁，用10％的naoh或hcl溶液调ph值至4，充氮气，在120r/min搅拌下缓慢升温至45℃，继续搅拌反应至设定时间，停止反应。冷却后将反应液在4000r/min下离心20min，得到沉淀，抽滤，收集滤渣，并用乙醇(3×10ml)复洗涤后，抽滤，最后真空干燥得丹参亚铁多糖。
表1-5反应时间对收率的影响
由表1-5可以看出，不同反应时间条件下，铁鳌合率和丹参亚铁多糖得率不同，说明反应时间对鳌合反应效果的影响较大，多糖与铁的鳌合反应时间60min条件下，得率最高。
1.3小结
1.3.1.从简化产物分离操作考虑，采用乙醇亚铁盐在不同浓度乙醇中的溶解性可知，氯化亚铁能完全溶于不同浓度的乙醇溶液中，更适合作为鳌合反应的铁源。
1.3.2.通过优化工艺，确定丹参多糖与亚铁盐发生鳌合反应的最佳反应条件。
实施例2丹参亚铁多糖作为饲料添加剂对哺乳仔猪血红蛋白含量及其生长效果的影响
由于目前市场上的补铁剂品类繁多，仅在兰州市西固区兽药市场常见的就有多种不同品牌的补铁剂，但其补铁效果并不明确。本试验旨在通过研究丹参亚铁多糖对哺乳仔猪体内血红蛋白的含量及哺乳仔猪生长效果的影响，来确定丹参亚铁多糖对哺乳仔猪有应用价值及实用效果，为丹参亚铁多糖生产提供可理论依据。
2.1材料与方法
2.1.1试验时间和地点
试验从2017年8月20日至11月30日，地点选在甘肃凯悦综合养殖场。
2.1.2供试药物
丹参亚铁多糖：按本发明方法制备。
乳酸亚铁：石家庄市天成食品添加剂厂。
富马酸亚铁：宁乡县佳源生物科技有限公司。
2.1.3供试动物
试验选用甘肃凯悦综合养殖场的70头初生仔猪，品种为长白×约克，采用舍内高床饲养。
2.1.4方法
2.1.4.1供试仔猪的分组与处理
90头供试仔猪其中80头随机分为4组，根据预试验的结果，根据3种产品的含量不同，通过计算确定剂量。在仔猪出生的2日龄开始试验，剂量为1组(乳酸亚铁配制成100ml水，0.3g/d)、2组(富马酸亚铁配制成100ml水，1g/d)、3组(丹参亚铁多糖3g/d，配制成100ml水)、4组(100ml水)，试验，1、2、3组饮水不同补铁剂，试验4组为空白对照组，用于测定空白仔猪体内血红蛋白含量变化。在试验期内，各试验组的哺乳仔猪进行相同的饲养管理，按常规程序对仔猪进行免疫，驱虫，去势和消毒。
2.1.4.2血红蛋白含量测定
试验1、2、3、4组分分别在12日龄(补铁后第10天)采血，用沙利氏血红蛋白计测其血红蛋白含量值。试验4组分别在3，6，9，12和15日龄时采血测其体内血红蛋白含量，并根据这些数值描出哺乳仔猪未补铁时体内血红蛋白含量变化。
1.4.3数据处理在仔猪初生时称其初生重，饲喂30d后断奶称其断奶重，并在试验期内，记录仔猪患病头数，死亡头数。对所测得的初生重、断奶重、患病头数和死亡头数，经计算得出日增重、腹泻发生率、存活率等。
2.2结果
2.2.1不同补铁剂对哺乳仔猪初生到断奶期间生长效果的影响
结果表明，这3种补铁剂都能提高仔猪日增重，并能有效地降低仔猪腹泻发生率。其中各试验组平均日增重较对照组分别提高了27.8，35.4g和54.1g；腹泻发生率较对照组分别降低了13.1％，20.3％和27.1％；断奶成活率均达到100％，比对照组提高了18％。因此，试验组的仔猪都比对照组的仔猪生长发育好，患病少，特别是3组小猪明显生成健康。
2.2.2从3种补铁剂的补铁效果看，3种补铁剂都能明显提高仔猪体内血红蛋白含量，并促进生长发育，预防和减少疾病的发生。但经过试验比较，3种补铁剂中丹参亚铁多糖的效果最好。饮水丹参亚铁多糖后，12日龄试验仔猪体内血红蛋白含量值较对照组高2.7g/100ml。
表2-1不同补铁剂对仔猪生长效果的影响
表2-2不同补铁剂对仔猪体内血红蛋白12日龄含量的影响
实施例3丹参亚铁多糖的急性毒性试验
饲料添加剂的功能第一是营养功能，它提供动物所需要的基础营养素，以满足动物健康生长的需要，所以就要求该饲料添加剂本身是绝对安全，为了证明该产品的是否安全，本实施例对丹参亚铁多糖的急性毒性进行测试。
3.1材料与方法
3.1.1试验材料
丹参亚铁多糖：按本发明方法制备；小白鼠由兰州大学实验动物中心提供，体重为(17.00±1)g。动物房及实验室温度为(24±1)℃，光照黑暗每12h更替。试验小白鼠于试验前在动物房适应一周，塑料笼饲养，每周更换垫料3次，自由摄食摄水。
3.1.2试验方法
预试验试验前对小白鼠进行7d喂养观察，观察期内小白鼠自由饮水、采食，每日空腹称量体质量，淘汰自然死亡小白鼠。预试验期内选取40只小白鼠，随机分为5组，每组8只，雌雄各半。按312.5、625、1250、2500、5000mg/kg剂量1次性灌胃给药，确定正式试验的剂量范围。
急性毒性试验另取只小白鼠20随机分为2组。给药组以最大质量浓度(1.0g/ml)、最大容积(1.6ml)1次性灌胃受试药物，对照组用等体积生理盐水，给药后连续观察48h，测定最大给药量。正式试验时，将小白鼠随机分为4组(对照组和给药组，给药组药剂量分别为1250、2500、5000mg/kg)，每组10只，雌雄各半，共40只。灌胃前后6h禁食(自由饮水)，试验组均按每只小白鼠的体质量计算给药量，金属灌胃器一次性灌胃给药。对照组小白鼠保持自由采食和饮水。给药后每天观察小白鼠的采食、饮水、死亡、精神、被毛和自主活动等，连续观察7d。及时解剖死亡小白鼠，记录病变情况，并在第8天称量所有小白鼠体质量并解剖，观察腹腔内液体情况和实质性器官的病理变化。
3.2结果与分析
经口1次灌服后，各试验组小白鼠均未见死亡病例，按寇式改良法不能计算出该制剂的半数致死量(ld50)。该结果表明本发明的黄芪锌多糖的ld50大于5000mg/kg，按药物毒性分级标准，认为本发明的丹参亚铁多糖实际无毒。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。