靶向CCR4嵌合抗原受体的方法和用途与流程

本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向ccr4嵌合抗原受体及其用途。

背景技术：

c-c基序趋化因子受体4(ccr4)是七个跨膜g蛋白偶联的细胞表面受体分子(或者称为cd194)，其在造血系统的细胞上具有选择性表达(yoshieandmatsushima,intimmunol.2015；27(1):11-20；solariandpease,eurjpharmacol.2015；.pii:s0014-2999(15)30011)。在健康个体的外周血中，cd4⁺cd25⁺foxp3⁺τ调节(treg)细胞，th2和th17细胞以及血小板显示出优势的ccr4表达(hiraharaetal.,jimmunol.2006；177(7):4488-4494；d'ambrosioetal.,jimmunol.1998；161(10):5111-5115；annunziatoetal.,jexpmed.2007；204(8):1849-1861；clemetsonetal.,blood.2000；96(13):4046-4054；abi-younesetal.,thrombres.2001；101(4):279-289).正如其他趋化因子受体所见，尽管ccr4在其配体特异性中显示出一定程度的混杂性，但c-c趋化因子ccl17和ccl22是该受体的主要高亲和力配体，而mcp-1，mip-1和rantes也显示出显着的配体活性(andrewetal.,jimmunol.1998；161(9):5027-5035；imaietal.,jbiolchem.1998；273(3):1764-1768；zlotniketal.,immunity.2000；12(2):121-127).在多种肿瘤中观察到ccl17和ccl22异常过表达，特别是由基质细胞过表达，包括乳腺癌，卵巢癌，胃癌和食道癌以及淋巴恶性肿瘤如霍奇金病(gobertetal.,cancerres.2009；69(5):2000-2009；fialovaaetal.,intjcancer.2013；132(5):1070-1079；curieletal.,natmed.2004；10(9):942-949；yangetal,plosone.2015；10(3):e0120059；maruyamaetal.,disesophagus2010；23(5):422-429；ishidaetal.,cancerres.2006；66(11):5716-5722)。这是ccr4携带tregs大量流入这种恶性肿瘤的肿瘤微环境的主要驱动因素，这种恶性肿瘤不仅会阻碍有效的抗肿瘤免疫反应，还会促进肿瘤的运输和转移。

mogamulizumab是一种去糖基化的人源化抗体，经过工程改造可发挥针对ccr4的增强的抗体依赖性细胞毒作用，并在日本被批准用于治疗复发或难治性成人t细胞白血病/淋巴瘤(subramaniametal.,drugs.2012；72(9):1293-1298)并且积累的证据表明，即使在经过大量预处理的病人身上，这种方式也具有相当大的功效(orugaetal.,jclinoncol.2014；32(11):1157-1163)。除了发热和皮肤病之外，所观察到的不良事件主要是血液学性质，这些不仅是易于控制的，而且是可逆的(oguraetal.,jclinoncol.2014；32(11):1157-1163；duvicetal.,blood.2015；125(12):1883-1889.)同样重要的是，mogamulizumab疗法还选择性地消耗效应类型foxp3⁺cd4⁺tregs，导致治疗患者中诱导的抗肿瘤反应增强(sugiyamaetal.,procnatlacadsciusa2013；110(44):17945-17950；nietal.,clincancerres.2015；21(2):274-285)。因此，仍然需要靶向ccr4的其他治疗剂，例如用于治疗成人t细胞白血病，皮肤t细胞淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤和表达ccr4的其他淋巴瘤。

嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor-tcell，car-t)t细胞是指经基因修饰后，能以mhc非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的t细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。嵌合抗原受体(car)是car-t的核心部件，赋予t细胞hla非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过car改造的t细胞相较于天然t细胞表面受体tcr能够识别更广泛的目标。car的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scfv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于car的特异性、有效性以及基因改造t细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

技术实现要素：

在一些实施方案中，公开了嵌合抗原受体，其包括：(a)scfv，其包含mab2-3抗体的轻链可变结构域(vl)和重链可变结构域(vh)，其中scfv特异性结合ccr4；(b)来自cd8的铰链和跨膜结构域；(c)细胞内4-1bb信号传导结构域；(d)细胞内cd3ζ信号传导结构域，其中(a)-(d)是n末端至c末端的顺序。本发明第二方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。

本发明第三方面提供一种病毒，其中病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。

本发明第四方面提供一种细胞，所述细胞为载体转导的cd3⁺t细胞或天然杀伤细胞。

本发明第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合其包含有效量的的载体或治疗有效量的cd3⁺t细胞和/或天然杀伤细胞和药学上可接受的载体。

在一个或多个实施方案中，所述ccr4介导的疾病为成人t细胞白血病，皮肤τ细胞淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。

附图说明

图1：ccr4-car逆转录病毒表达载体示意图。

具体实施方式

本文公开了治疗肿瘤的方法，其中肿瘤细胞表达ccr4，特别是它们产生编码ccr4和/或ccr4蛋白的mrna。在一些实施方案中，肿瘤是恶性肿瘤，例如淋巴恶性肿瘤。淋巴恶性肿瘤可以是成人τ细胞白血病，皮肤τ细胞淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤或弥漫性大β细胞淋巴瘤。成人τ细胞白血病可以是慢性，急性，阴燃或淋巴瘤类型。皮肤τ细胞淋巴瘤可以是蕈样真菌病，瘙痒性网状细胞病，sezary综合征，肉芽肿性皮肤松弛症，淋巴瘤样丘疹病，慢性糠疹性糠疹，糠疹性糠疹，变形虫，cd30+皮肤t细胞淋巴瘤，继发性皮肤cd30+大细胞淋巴瘤，非蕈样真菌病cd30-皮肤大t细胞淋巴瘤，多形性t细胞淋巴瘤，lennert淋巴瘤，皮下t细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤或急性nk细胞淋巴瘤。在具体的非限制性实例中，皮肤t细胞淋巴瘤是外周t细胞淋巴瘤(ptcl)/皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)或蕈样真菌病(mf)/sezary综合征(ss)。在其他实施方案中，肿瘤是实体瘤，其中肿瘤细胞表达ccr4，特别是它们产生编码ccr4和/或ccr4蛋白的mrna。实体瘤的具体非限制性实例，例如实体恶性肿瘤，是乳腺癌，卵巢癌，胃癌或食道癌。不受理论束缚，可以使用本文公开的car靶向微环境中的treg。

ccr4嵌合抗原受体的构建及逆转录病毒库的制备:已经报道了抗人ccr4单克隆抗体1567其分子构型如图1所示。cd8铰链和跨膜结构域，4-1bb(cd137)信号传导模块和cd3ζ信号传导模块的氨基酸序列分别衍生自登录号nm_001768，u03397.1和nm_00734，其通过引用并入本文。将各个结构域序列组装成一个转录/翻译单元，并从头合成功能单元的密码子优化的dna序列。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1：ccr4car基因序列的确定

从ncbi网站数据库搜索到抗ccr4抗体重链和轻链可变区基因序列信息(1567)，序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

各基因核苷酸和氨基酸序列信息见(sequnceidno.1-2)

将上述序列依次进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整ccr4car基因序列信息。

实施例2：包含car分子的核酸序列的病毒载体的构建

将实施例1中制备的car分子的核苷酸序列经noti(neb)和ecori(neb)双酶切、经t4连接酶(neb)连接插入逆转录病毒rv载体的noti-ecori位点，转化到感受态e.coli(dh5α)，将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的ccr4car序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：

正义序列:agcatcgttctgtgttgtctc(sequnceidno.3)

反义序列:tgtttgtcttgtggcaatacac(sequnceidno.4)

经测序正确后，使用qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293t细胞进行逆转录病毒包装实验。

本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。

实施例3：逆转录病毒包装

1.第1天293t细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6*10^6cells/ml铺板，10cm皿添加10ml的dmem培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜。

2.第2天293t细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为retrobackbone(mscv)为12.5ug，gag-pol为10ug，vsvg为6.25ug，cacl2250ul，h2o为1ml总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的hbs，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293t皿中，37度培养4h，去除培养基，pbs洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。

3.第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80度，继续添加预热的新鲜dmem培养基。

序列表

<110>上海恒润达生生物科技有限公司

<120>靶向ccr4嵌合抗原受体的方法和用途

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列(homosapiens)

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