一种番鸭细小病毒的检测引物及检测试剂盒与应用的制作方法

本发明涉及动物检验检疫领域，具体而言，涉及一种番鸭细小病毒的检测引物及检测试剂盒与应用。

背景技术：

番鸭细小病毒型“白点病”，又叫番鸭“肝白点病”、“花肝病”、“白点病”。本病以肝、脾出现白色坏死点为主要临床病变，并且主要侵害三周龄以内的雏番鸭。该病的发病率为30％～90％，死亡率为60％～80％。发病日龄越早,病情越严重。1950年kaschula等在南非首次报道了该病的发生；1972年，法国学者gaudry等在国际上首次从患病番鸭中分离到了呼肠孤病毒。目前该病广泛流行于法国、以色列、德国、意大利等国；1997年，该病在我国首次出现。由于该病具有较高的发病率和死亡率，因此引起了国内外的关注。目前国内外不少学者对该病病原进行了研究，得出多种结果，有些学者怀疑该病的病原是细菌、细小病毒变异株、鸭病毒性肝炎弱毒株等，还有些学者从中分离到了呼肠孤病毒、疱疹病毒、细小病毒等。2003年，华南农业大学传染病学教研室禽病组在国内外首次确认番鸭细小病毒型“白点病”可由细小病毒单独引起。

但研究发现：番鸭细小病毒型“白点病”病原属于新型的番鸭细小病毒，直径25～30nm、圆形。另外，该病常与番鸭小鹅瘟或番鸭“三周病”发生混合感染，特别是后两者在临床症状和病理变化上非常相似，因此给检测带来困难，甚至出现误诊。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种番鸭细小病毒的检测引物，该检测引物能准确、灵敏的检测出番鸭细小病毒。

本发明的第二目的在于提供上番鸭细小病毒的检测引物在番鸭细小病毒检测中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述番鸭细小病毒的检测引物在制备检测番鸭细小病毒试剂盒中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种番鸭细小病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的番鸭细小病毒的检测引物。

本发明的第五目的在于提供上述的检测试剂盒在检测番鸭细小病毒中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种番鸭细小病毒的检测引物，检测引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；第一引物对的碱基序列如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列如seqidno.5-6所示。

上述的番鸭细小病毒的检测引物在番鸭细小病毒检测中的应用。

上述番鸭细小病毒的检测引物在制备检测番鸭细小病毒试剂盒中的应用。

一种番鸭细小病毒的检测试剂盒，该检测试剂盒包括上番鸭细小病毒的检测引物。

上述的检测试剂盒在检测番鸭细小病毒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的番鸭细小病毒检测引物能准确地、特异地检测出番鸭细小病毒，能够快速准确的检测出目的病毒，具有较高的灵敏度；应用该检测引物检测番鸭细小病毒能提高检测的准确性，且应用该检测引物制备检测番鸭细小病毒的试剂盒可以方便应用，检测快速灵活。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1提供的pcr反应体系优化电泳结果图；

图2为本发明实验例1提供的第一引物对退火温度结果电泳图；

图3为本发明实验例1提供的第二引物对退火温度结果电泳图；

图4为本发明实验例1提供的第三引物对退火温度结果电泳图；

图5为本发明实验例1提供的第一引物对浓度优化电泳结果图；

图6为本发明实验例1提供的第一引物对浓度优化电泳结果图；

图7为本发明实验例1提供的第一引物对浓度优化电泳结果图；

图8为本发明实验例1提供的第二引物对浓度优化电泳结果图；

图9为本发明实验例1提供的第三引物对浓度优化电泳结果图；

图10为本发明实验例2提供的第一引物对的灵敏性实验结果图；

图11为本发明实验例2提供的第二引物对的灵敏性实验结果图；

图12为本发明实验例2提供的第三引物对的灵敏性实验结果图；

图13为本发明实验例2提供的第一引物对的特异性实验结果图；

图14为本发明实验例2提供的第一引物对的特异性实验结果图；

图15为本发明实验例2提供的第二引物对的特异性实验结果图；

图16为本发明实验例2提供的第二引物对的特异性实验结果图；

图17为本发明实验例2提供的第三引物对的特异性实验结果图；

图18为本发明实验例2提供的第三引物对的特异性实验结果图；

图19为本发明实验例3提供的实验样本检测电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种番鸭细小病毒的检测引物及检测试剂盒与应用进行具体说明。

番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(muscovyduckparvovrius，mpv)引起3周龄内雏番鸭以喘气、腹泻及胰脏坏死和出血为主要特征的传染病。与小鹅瘟有相似性，但致死率不同。番鸭细小病毒病是雏番鸭的一种急性传染病。病理变化是纤维素性肠炎、胰脏呈点状坏死，以3周龄内的雏番鸭多发，最早是3日龄发病。病鸭张口呼吸、喘气，消瘦、拒食、蹲伏，十二指肠内容物呈松散栓子状，表层有脱落的黏膜附着。

一种番鸭细小病毒的检测引物，检测引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；第一引物对的碱基序列如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列如seqidno.5-6所示。

第一引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-ccgcttatttccaactgac-3’；

第一引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gccatagaagggaacagtga-3’；

第二引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-catcacaagcggaacattg-3’；

第二引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gcattcctgccaggttac-3’；

第三引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-gaagtcagtgcggcacat-3’；

第三引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-ggacatttgcatcttgtctc-3’。

上述引物序列是通过生物信息学的方法对番鸭细小病毒基因组序列进行分析后，确定番鸭细小病毒的保守序列，然后通过序列设计软件设计和人工优化后得到。

上述检测引物的退火温度合适，扩增的目的片段长度合适，节约检测反应的时间，方便快速地获得检测结果；同时检测引物针对性强，特异性好，灵敏度高，检测结果可靠准确。在保证检测准确性的前提下，缩短反应时间。

上述的番鸭细小病毒的检测引物在番鸭细小病毒检测中的应用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述的番鸭细小病毒的检测引物在番鸭细小病毒检测中的应用，包括以待检样本为模板进行pcr反应；

pcr反应的退火温度为50℃-56℃，退火时间为48-53℃。

选择50℃-56℃退火温度，能扩增出较好的目的条带，避免扩增出非特异的条带干扰实验结果，能较好的将微量的模板放大，利于快速反应，快速拿到检测结果。

上述番鸭细小病毒的检测引物在制备检测番鸭细小病毒试剂盒中的应用。

一种番鸭细小病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的检测引物。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，还包括pcr反应缓冲液、taqdna聚合酶和dntps中至少一种；以及2×superrealpremix、2×sybrgreeni和rox中的至少一种。

试剂盒中，包括进行普通pcr的试剂，可以对样本的番鸭细小病毒进行快速的检测分析。包含进行荧光定量pcr的试剂，还可以通过荧光定量pcr对待检样本进行定量分析，可以获得较好的、精确的检测结果。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，还包括核酸提取试剂。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，核酸提取试剂包括sds溶液。

通过核酸提取试剂，可以快速的提取获得待检样本中dna，利用待检dna样本，进行快速检测。

上述的检测试剂盒在检测番鸭细小病毒中的应用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，包括制备待检dna样本，以待检dna样本为模板，进行pcr反应；

pcr反应的退火温度为50℃-56℃，退火时间为48s-53s；

制备待检dna样本包括将番鸭尿囊液加入sds溶液经95-106℃处理8-12min，水浴4-8min，15000rpm离心9-12min，取上清得到待检dna样本。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种番鸭细小病毒的检测引物，该检测引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；第一引物对的碱基序列如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列如seqidno.5-6所示。

第一引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-ccgcttatttccaactgac-3’；

第一引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gccatagaagggaacagtga-3’；

第二引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-catcacaagcggaacattg-3’；

第二引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gcattcctgccaggttac-3’；

第三引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-gaagtcagtgcggcacat-3’；

第三引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-ggacatttgcatcttgtctc-3’。

番鸭细小病毒的检测引物，具体使用方法如下：

1.1取3个实验管，分别加入0.5μl待检样本为模板，加入2×taqmix10μl，seqidno.1-6对应的第一引物对、第二引物对和第三引物对各0.5μl分别加入对应的试验管，然后加入ddh2o，补足反应体系到20μl；

1.2进行pcr反应程序为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；50℃，退火48s；72℃，延伸30s；30个循环；72℃，10min。

1.3反应结束后，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳；

1.4琼脂糖凝胶电泳结束后，对凝胶进行查看，通过电泳的条带判断结果。

实施例2

本实施例提供一种番鸭细小病毒的检测引物，该检测引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；第一引物对的碱基序列如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列如seqidno.5-6所示。

第一引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-ccgcttatttccaactgac-3’；

第一引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gccatagaagggaacagtga-3’；

第二引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-catcacaagcggaacattg-3’；

第二引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gcattcctgccaggttac-3’；

第三引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-gaagtcagtgcggcacat-3’；

第三引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-ggacatttgcatcttgtctc-3’。

番鸭细小病毒的检测引物，具体使用方法如下：

1.1取3个实验管，分别加入0.5μl待检样本为模板，加入2×taqmix10μl，seqidno.1-6对应的第一引物对、第二引物对和第三引物对各0.5μl分别加入对应的试验管，然后加入ddh2o，补足反应体系到20μl；

1.2进行pcr反应程序为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；56℃，退火53s；72℃，延伸30s；30个循环；72℃，10min。

1.3反应结束后，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳；

1.4琼脂糖凝胶电泳结束后，对凝胶进行查看，通过电泳的条带判断结果。

实施例3

本实施例提供一种番鸭细小病毒的检测引物，该检测引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；第一引物对的碱基序列如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列如seqidno.5-6所示。

第一引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-ccgcttatttccaactgac-3’；

第一引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gccatagaagggaacagtga-3’；

第二引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-catcacaagcggaacattg-3’；

第二引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gcattcctgccaggttac-3’；

第三引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-gaagtcagtgcggcacat-3’；

第三引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-ggacatttgcatcttgtctc-3’。

番鸭细小病毒的检测引物，具体使用方法如下：

1.1取3个实验管，分别加入0.5μl待检样本为模板，加入2×taqmix10μl，seqidno.1-6对应的第一引物对、第二引物对和第三引物对各0.5μl分别加入对应的试验管，然后加入ddh2o，补足反应体系到20μl；

1.2进行pcr反应程序为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；53℃，退火50s；72℃，延伸30s；30个循环；72℃，10min。

1.3反应结束后，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳；

1.4琼脂糖凝胶电泳结束后，对凝胶进行查看，通过电泳的条带判断结果。

因此，可以将番鸭细小病毒的检测引物用于制备检测番鸭细小病毒的检测试剂盒。

实施例4

本实施例提供一种番鸭细小病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括番鸭细小病毒的检测引物，该检测引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；第一引物对的碱基序列如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列如seqidno.5-6所示。

第一引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-ccgcttatttccaactgac-3’；

第一引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gccatagaagggaacagtga-3’；

第二引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-catcacaagcggaacattg-3’；

第二引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gcattcctgccaggttac-3’；

第三引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-gaagtcagtgcggcacat-3’；

第三引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-ggacatttgcatcttgtctc-3’。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行pcr反应的pcr反应缓冲液、taqdna聚合酶和dntps中至少一种；以及进行荧光定量pcr反应的2×superrealpremix、2×sybrgreeni和rox中的至少一种。

还包括核酸提取试剂，核酸提取试剂采用sds溶液制备得到。

本实施例提供的试剂盒的使用方法，具体如下：

1.1将取自番鸭尿囊液的待检样本200μl，加入100μl核酸提取试剂；

1.2在95℃条件下处理12min；立即冰浴8min；

1.3在15000rpm离心9min，取上清液作为待检dna样本；

1.4以待检dna样本5μl为模板进行试验，加入pcr反应缓冲液10μl、dntp(2.5mm)2.0μl、上下游引物各1.0μl，taqdna聚合酶0.3μl，ddh2o补足至250μl；

1.5进行pcr反应程序为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；50℃，退火53s；72℃，延伸30s；30个循环；72℃，10min。

实施例5

本实施例提供一种番鸭细小病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括番鸭细小病毒的检测引物，该检测引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；第一引物对的碱基序列如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列如seqidno.5-6所示。

第一引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-ccgcttatttccaactgac-3’；

第一引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gccatagaagggaacagtga-3’；

第二引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-catcacaagcggaacattg-3’；

第二引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gcattcctgccaggttac-3’；

第三引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-gaagtcagtgcggcacat-3’；

第三引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-ggacatttgcatcttgtctc-3’。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行pcr反应的pcr反应缓冲液、taqdna聚合酶和dntps中至少一种；以及进行荧光定量pcr反应的2×superrealpremix、2×sybrgreeni和rox中的至少一种。

还包括核酸提取试剂，核酸提取试剂采用sds溶液制备得到。

本实施例提供的试剂盒的使用方法，具体如下：

1.1将取自番鸭尿囊液的待检样本200μl，加入100μl核酸提取试剂；

1.2在106℃条件下处理8min；立即冰浴4min；

1.3在15000rpm离心12min，取上清液作为待检dna样本；

1.4以待检dna样本5μl为模板进行试验，加入pcr反应缓冲液10μl、dntp(2.5mm)2.0μl、上下游引物各1.0μl，taqdna聚合酶0.3μl，ddh2o补足至250μl；

1.5进行pcr反应程序为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；56℃，退火48s；72℃，延伸30s；30个循环；72℃，10min。

实施例6

本实施例提供一种番鸭细小病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括番鸭细小病毒的检测引物，该检测引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；第一引物对的碱基序列如seqidno.1-2所示，第二引物对的碱基序列如seqidno.3-4所示，第三引物对的碱基序列如seqidno.5-6所示。

第一引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-ccgcttatttccaactgac-3’；

第一引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gccatagaagggaacagtga-3’；

第二引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-catcacaagcggaacattg-3’；

第二引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gcattcctgccaggttac-3’；

第三引物对的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-gaagtcagtgcggcacat-3’；

第三引物对的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-ggacatttgcatcttgtctc-3’。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行pcr反应的pcr反应缓冲液、taqdna聚合酶和dntps中至少一种；以及进行荧光定量pcr反应的2×superrealpremix、2×sybrgreeni和rox中的至少一种。

还包括核酸提取试剂，核酸提取试剂采用sds溶液制备得到。

本实施例提供的试剂盒的使用方法，具体如下：

1.1将取自番鸭尿囊液的待检样本200μl，加入100μl核酸提取试剂；

1.2在100℃条件下处理10min；立即冰浴5min；

1.3在15000rpm离心10min，取上清液作为待检dna样本；

1.4以待检dna样本5μl为模板进行试验，加入pcr反应缓冲液10μl、dntp(2.5mm)2.0μl、上下游引物各1.0μl，taqdna聚合酶0.3μl，ddh2o补足至250μl；

1.5进行pcr反应程序为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；50℃，退火50s；72℃，延伸30s；30个循环；72℃，10min。

实验例1

本实验例提供验证实施例6提供的试剂盒的pcr反应条件的优化的实验。

本实验中pcr的样本的制备方法参考实施例6。

pcr反应体系的优化，以25μl反应体积,采用固定一种成分，其他成分过量的方法进行筛选。taqdna聚合酶分别为0.3μl、0.5μl和1.0μl(5u/μl)；dntps分别为0.5μl、1.0μl和2.0μl(2.5mmol/l)。上、下游引物均为1.0μl(20μm)。

pcr反应退火温度优化，25μl反应体系：ddh2o14.2μl、10×pcrbuffer2.5μl、dntp(2.5mm)2.0μl、上游引物1.0μl、下游引物1.0μl、模板dna5μl、taqdna聚合酶0.3μl。pcr循环参数为94℃预变性3min，94℃变性50s，退火温度分别做梯度变化(第一引物对：50-56℃，第二引物对：48-56℃，第三引物对:50～54.8℃)，退火时间50s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸10min。

引物浓度优化实验；在25μl反应体系中，加入引物体积(浓度为20μlm)分别为0.5μl，1.0μl，1.5μl，2.0μl，2.5μl，然后进行pcr扩增。

反应体系优化试验结果如图1所示，按pcr反应效率最高、用量最少为标准确定为最佳反应条件；可知taqdna聚合酶用量为0.3μl，dntps用量为2.0μl。

pcr反应退火温度的优化实验结果如图2、图3和图4所示，退火温度在50℃-56℃之间变化时，三组pcr的产物的产率没有太大变化，所以本试验退火温度对引物的影响不是很大，因此pcr反应退火温度范围控制在50℃-56℃之间较好。

第一引物对的浓度优化实验结果如图5、图6和图7所示，第一引物对的工作浓度为20μm，结果较优。

第二引物对的浓度优化结果如图8所示，第二引物对的工作浓度为20μm，结果较优。

第三引物对的浓度优化结果如图9所示，第二引物对的工作浓度为20μm，结果较优。

实验例2

本实验例提供对实施例6提供的检测试剂盒的灵敏性、可重复性和特异性进行检验。

灵敏性实验

以阳性样本作为模板，分别以原液、稀释10倍和稀释100倍的样本作为模板，分别用三种引物对进行pcr反应检验。pcr反应具体参数参考实施例6。

实验结果10、图11和图12所示，三种引物对均能检测出样本，获得较好的实验结果，所以，本发明提供的检测引物具有较好到灵敏性。

特异性实验

以番鸭细小病毒以及呼肠弧病毒和鸭病毒性肝炎病毒为待检样本检测三对引物对的检测特异性，阴性对照添加等量的去离子水。

第一引物对的特异性检测结果如图13和图14所示，第二引物对的特异性检测结果如图15和图16所示和第三引物对的特异性检测结果如图17和图18所示；图中m表示dnamarker200，1表示番鸭细小病毒扩增结果，2表示呼肠弧病毒扩增结果，3表示鸭病毒性肝炎病毒括这结果，4表示阴性对照；可以看出，第一引物对、第二引物对和第三引物对均能特异的扩增出目的条带，而呼肠弧病毒和鸭病毒性肝炎病毒以及阴性对照均没有扩增出条带。可见本发明实施例提供的检测引物具有较好的特异性。

重复性实验

以阳性样本为模板，用三对引物对进行三次pcr反应，验证三对引物的可重复性。

重复实验结果发现，三对引物对的重复性实验结果较好。

实验例3

本实验例以实验室获得番鸭的肝脏、脾脏和胰脏的离体样本进行检测，具体实验方法参考实施例6；进行pcr扩增反应。

具体实验结果如图19所示，可见番鸭的肝脏样本中能检测出目标条带。

综上所述，本发明实施例提供的番鸭细小病毒的检测引物具有较好的特异性和较高的灵敏度，使用该检测引物应用于检测番鸭细小病毒，以及应用于制备检测番鸭细小病毒的试剂盒，都具有较好的特异性和较高的灵敏度；检测番鸭细小病毒的试剂盒方便提取病毒的核酸并进行鉴定，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

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<110>华南农业大学、惠州工程职业学院

<120>一种番鸭细小病毒的检测引物及检测试剂盒与应用

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