甲状腺癌分子诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及辅助诊断试剂盒领域，具体而言，涉及一种甲状腺癌分子诊断试剂盒。

背景技术：

甲状腺癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其病理学类型包括甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌、未分化型甲状腺癌和甲状腺髓样癌。其中，甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌因癌细胞分化较好而被称为分化型甲状腺癌，在甲状腺癌中的占比超过90％。据相关文献报道，在全球范围内，甲状腺癌的发病率以每年4％的速率逐年上升，成为增长最快的一种癌症。国家癌症中心2017年最新发布的数据显示，甲状腺癌总体发病率为10.16/10万，居恶性肿瘤发病率第7位，在女性中发病率为15.6/10万，居恶性肿瘤发病率第5位。

甲状腺结节是指由放射线照射等各种原因导致甲状腺内出现一个或多个组织结构异常的团块。甲状腺结节临床极为常见，多见于女性。甲状腺结节多为良性，恶性结节仅占5％左右。b超是目前检查甲状腺结节的首选手段，根据甲状腺结节的影像学特点可以初步判断其性质。对于难以判断良恶性的结节需要进一步行ct、mri、细胞穿刺等检查来确定。但当甲状腺癌病变较小时，与结节性甲状腺肿难以区分，给临床和影像诊断带来一定困难。良性甲状腺结节和甲状腺癌的临床处理及预后差异很大，如不能及时准确地鉴别甲状腺结节的良恶性，对甲状腺癌病人就意味着延迟诊断或误诊，从而耽误了治疗。因此尽早对甲状腺结节的良恶性进行准确判别和相应治疗，不仅能够节约整个社会的医疗资源，也能在一定程度上提高患者的长期存活率，最终使患者获益。

b超检查是目前诊断甲状腺结节首选的影像学检查方法，具有简便、重复性好、无创、快捷、无电离辐射、价格便宜等优点。b超检查能够发现2mm以上的囊性结节和3mm以上的实性结节，可以清晰显示结节形状、内部回声、血供状态及有无钙化，并依此提示甲状腺结节的良恶性。但b超检查不能确诊甲状腺癌，更不能确定其病理类型。此外b超检查发现的微小结节，可能并无临床意义，但会给病人带来恐惧，由于其性质的不确定性，也给医生带来困惑。

如果b超检查结果高度怀疑恶变，需要做甲状腺细针穿刺和细胞学检查，也叫fnac检查，是目前鉴别甲状腺结节良恶性最可靠的诊断方法。该方法不受甲状腺结节大小的限制，在超声引导下对甲状腺结节进行穿刺检查，几乎无任何并发症，可重复操作，而且未见肿瘤种植的报道。但该方法抽取的细胞数量有限，因此只能观察细胞形态和结构变化，缺乏对整体组织的了解，而且受操作者技术水平和取样位置等因素影响较大，存在未诊断的情形，需要重复操作。同时操作较复杂，病人也需要承受较多心理和生理上的压力。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种甲状腺癌分子诊断试剂盒，以解决现有技术中检测复杂的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种甲状腺癌分子诊断试剂盒，该试剂盒包括：针对如下至少三个基因的检测试剂：ck19、survivin、tg、lgals3、met、tff3、serpina1、timp1、fn1、tpo、tgfa、qpct、crabp1、fcgbp、eps8、pros1、lrp4、dpp4、gjb3、st14、eva1、spuve、hbb、mkrn2、mrc2、igsf1、kiaa0830、rxrg、p4ha2、cdh3、il13ra1、mtmr4、mdk、cited1、chi3l1、odz1、n33、sftpb和scel。

进一步地，检测试剂包括扩增引物。

进一步地，试剂盒还包括用于捕获循环肿瘤细胞的捕获试剂。

进一步地，捕获试剂包括：淋巴细胞分离液、抗cd45的磁珠和epcam磁珠。

进一步地，捕获试剂包括：红细胞裂解液、抗cd45的磁珠和epcam磁珠。

进一步地，捕获试剂包括：细胞滤膜。

进一步地，试剂盒还包括：mrna提取试剂及反转录试剂。

进一步地，试剂盒还包括qpcr相关试剂。

进一步地，qpcr相关试剂包括检测探针或检测染料。

进一步地，试剂盒还包括链霉亲和磁珠或亲和素磁珠。

应用本发明的技术方案，通过选择上述在甲状腺癌组织高表达但在癌旁组织以及外周血单核细胞中低表达的基因，作为甲状腺癌组织特异性表达的maker基因，通过对这些基因的至少三个进行检测，即可通过这些marker基因表达量的高低来判断甲状腺结节的良恶性。利用该试剂盒进行检测，不仅操作简单便捷，可重复性高，不需要专门的仪器设备和技术人员，避免了取样操作本身对检测结果的影响，而且避免组织穿刺对病人带来的生理和心理上的不适，更重要的是最终展示的结果可以对甲状腺结节的良恶性进行明确判断，直观明了。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的实施例1的检测结果的roc曲线图；

图2示出了根据本发明的实施例1的检测结果的箱线图；以及

图3示出了根据本发明的实施例1的检测结果的散点图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，现有技术中对甲状腺癌的检测比较复杂，且对患者心理和生理上造成一定的压力，为了缓解这一现状，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种甲状腺癌分子诊断试剂盒，该试剂盒包括针对如下至少三个基因的检测试剂：ck19、survivin、tg、lgals3、met、tff3、serpina1、timp1、fn1、tpo、tgfa、qpct、crabp1、fcgbp、eps8、pros1、lrp4、dpp4、gjb3、st14、eva1、spuve、hbb、mkrn2、mrc2、igsf1、kiaa0830、rxrg、p4ha2、cdh3、il13ra1、mtmr4、mdk、cited1、chi3l1、odz1、n33、sftpb和scel。

上述甲状腺癌分子诊断试剂盒，通过选择上述在甲状腺癌组织高表达但在癌旁组织以及外周血单核细胞中低表达的基因，作为甲状腺癌组织特异性表达的maker基因，通过对这些基因的至少三个进行检测，即可通过这些marker基因表达量的高低来判断甲状腺结节的良恶性。利用该试剂盒进行检测，不仅操作简单便捷，可重复性高，不需要专门的仪器设备和技术人员，避免了取样操作本身对检测结果的影响，而且避免组织穿刺对病人带来的生理和心理上的不适，更重要的是最终展示的结果可以对甲状腺结节的良恶性进行明确判断，直观明了。

为了进一步提高该试剂盒在检测中的使用便利性，在一种优选的实施例中，检测试剂包括扩增引物。该试剂盒中直接包含了针对marker基因的扩增引物，便于直接对上述基因进行扩增检测。

为了进一步提高该试剂盒在对甲状腺癌特异表达基因检测的灵敏度和特异性，在一种优选的实施例中，试剂盒还包括用于捕获循环肿瘤细胞的捕获试剂。通过捕获患者外周血中的循环肿瘤细胞，并检测循环肿瘤细胞中甲状腺癌特异表达基因的表达水平的方法，来辅助鉴别患者甲状腺结节的良恶性。这样检测不仅属于无创检测，而且检测灵敏度和特异性均较好。

用于捕获循环肿瘤细胞的捕获试剂可以采用现有的捕获试剂，也可以是对现有捕获试剂进行改进的捕获试剂，只要能够捕获循环肿瘤细胞即可。

在一种优选的实施例中，捕获试剂包括：淋巴细胞分离液、抗cd45的磁珠和epcam磁珠。

在一种优选的实施例中，捕获试剂包括：红细胞裂解液、抗cd45的磁珠和epcam磁珠。

上述包括cd45磁珠和epcam磁珠，以及淋巴细胞分离液或红细胞裂解液的捕获试剂，通过先利用淋巴细胞分离液或红细胞裂解液从患者外周血中分离出单核细胞，然后用抗cd45的磁珠去除大量的白细胞，最后用epcam磁珠富集上皮来源的循环肿瘤细胞。这种捕获试剂对循环肿瘤细胞的捕获效率和捕获特异性高。

上述循环肿瘤细胞的捕获富集方法还可以用膜过滤等物理方法或其它基于表皮或癌细胞特异性标志物的富集方法代替。在一种优选的实施例中，捕获试剂包括：细胞滤膜。比如rarecellsdiagnostics公司的iset循环肿瘤细胞捕获仪，或其他8μm孔径的细胞滤膜。

由于该试剂盒可以通过检测与甲状腺癌相关的marker基因的表达量的高低来判断甲状腺结节的良恶性，为了进一步提高该试剂盒的检测便利性，在一种优选的实施例中，试剂盒还包括：mrna提取试剂及反转录试剂，便于直接利用试剂盒对待测样本进行mrna提取和反转录，从而检测相应marker基因的表达量。

进一步地，检测相应marker基因的表达量的方法采用现有的实时定量pcr的方法即可，具体所用到的试剂采用qpcr相关试剂即可。在一种优选的实施例中，试剂盒还包括qpcr相关试剂。在一种优选的实施例中，qpcr相关试剂包括检测探针或检测染料。先对富集得到的细胞进行裂解，然后用磁珠法分离mrna，反转录成cdna后，进行荧光定量pcr检测。

在一种优选的实施例中，试剂盒还包括链霉亲和磁珠或亲和素磁珠。

在本申请一种优选的实施例中，提供了一种本申请的甲状腺癌分子诊断试剂盒的使用方法，具体步骤如下：

(一)外周血单核细胞的分离

1)用edta管采集患者外周血8ml。

2)用pbs将8ml血液稀释1倍。

3)在50ml离心管中加入15mlficoll淋巴细胞分离液，并将稀释后的血液小心的加入分离液上层。

4)400g室温离心30min。

5)离心后出现分层，取中间的白膜层(即为细胞层)到一个新的15ml离心管中。

6)pbs洗涤细胞2次。

(二)白细胞去除

1)向细胞悬液中加入250μl的cd45磁珠，在旋转混匀仪上，4℃孵育30min。

2)将细胞-磁珠混合液贴在磁力架上。

3)待上清清澈、磁珠与磁体贴合，将上清吸出，转移至新管中。

(三)循环肿瘤细胞捕获及裂解

1)向细胞悬液中加入50ul的epcam磁珠。

2)在旋转混匀仪上，室温孵育30min。

3)将细胞磁珠混合液贴在磁力架上。

4)待上清清澈、磁珠与磁体贴合，将上清吸出。

5)用buffer1将磁珠洗5遍。

6)用100ul的lysisbuffer裂解磁珠，充分吹打以使捕获到的ctc充分裂解。

7)将磁珠裂解混合液贴在磁力架上，待上清清澈，磁珠与磁体贴合后，将上清吸出。

(四)循环肿瘤细胞mrna的提取及反转录

1)加入20μlmrna磁珠，混匀后，在旋转混匀仪上，室温孵育10min。

2)将磁珠混合液贴在磁力架上。

3)待磁珠与磁体贴合，吸出上清，加入100μl洗涤液。

4)轻缓吹起磁珠。

5)重复(2)(3)步1次。

6)加入12ul洗脱缓冲液，轻轻吹打混匀，放入80℃的恒温金属浴加热2min。

7)将磁珠混合液贴在磁力架上，待磁珠与磁体贴合，吸取上清，直接反转录成cdna。

(五)荧光定量pcr检测目的基因的表达水平

1)用10ul的反应体系进行qrt-pcr。

2)检测ck19、survivin、tg、lgals3、actin的ct值.

3)用△△ct的方法计算结果，并通过逻辑回归的方法进行结果分析。依据健康人、甲状腺结节良性及恶性病人ck19、survivin、tg、lgals3的表达量，划定cutoff值，即可判断甲状腺结节的良恶性。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。

实施例1

通过捕获收集患者外周血中的循环肿瘤细胞，检测循环肿瘤细胞中的特殊基因表达的方法，来鉴别患者甲状腺结节的良恶性。共入组109例研究对象，其中健康人20例、甲状腺结节良性患者36例、甲状腺癌患者53例。均通过以下步骤富集捕获外周血中的循环上皮细胞进行qpcr检测。

1、单核细胞的分离

1)用edta管采集8ml健康人和患者的外周血。

2)用pbs将8ml血液稀释1倍。

3)在50ml离心管中加入15mlficoll淋巴细胞分离液，并将稀释后的血液小心的加入分离液上层。

4)400g室温离心30min。

5)离心后出现分层，取中间的白膜层，即为细胞层，到一个新的15ml离心管中。

6)pbs洗涤2次。

2、白细胞去除

1)向细胞悬液中加入250μl的cd45磁珠，在旋转混匀仪上，4℃孵育30min。

2)将细胞-磁珠混合液贴在磁力架上。

3)待上清清澈、磁珠与磁体贴合，将上清吸出，转移至新管中。

3、循环上皮细胞捕获及裂解

1)向细胞悬液中加入50ul的epcam磁珠。

2)在旋转混匀仪上，室温孵育30min。

3)将细胞-磁珠混合液贴在磁力架上。

4)待上清清澈、磁珠与磁体贴合，将上清吸出。

5)用buffer1将磁珠洗5遍。

6)用100ul的lysisbuffer裂解磁珠，充分吹打以使捕获到的ctc充分裂解。

7)将磁珠裂解混合液贴在磁力架上，待上清清澈，磁珠与磁体贴合后，将上清吸出。

4、循环肿瘤细胞mrna的提取及反转录

1)加入20μlmrna磁珠，混匀后，在旋转混匀仪上，室温孵育10min。

2)将磁珠混合液贴在磁力架上。

3)待磁珠与磁体贴合，吸出上清，加入100μl洗涤液。

4)轻缓吹起磁珠。

5)重复(2)(3)步1次。

6)加入12ul洗脱缓冲液，轻轻吹打混匀，放入80℃的恒温金属浴加热2min。

7)将磁珠混合液贴在磁力架上，待磁珠与磁体贴合，洗出上清，直接反转录成cdna。

5、荧光定量pcr检测目的基因的表达水平

1)用10ul的反应体系进行qrt-pcr检测。

2)检测ck19、survivin、tg、lgals3、actin的ct值。

3)用△△ct的方法计算结果，并通过逻辑回归的方法进行结果分析。

6、结果分析

检测结果见表1及图1至图3。

表1.入组患者检测基因ct值

对表1中的数据进行逻辑回归分析后，画出的roc曲线图(图1)、箱线图(图2)、散点图(图3)。

从表1、图1、图2及图3的结果可以看出，通过富集捕获患者外周血中的循环肿瘤细胞，检测ck19、survivin、tg、lgals3的方法来判断甲状腺结节患者的良恶性，结果的敏感性可达到74％，特异性可达到74.47％。这种无创辅助诊断的方法可应用于临床。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

完全不同于传统的疾病影像学和病理学检测方法，本申请的检测试剂盒的检测思路和方法是基于近年来迅速兴起的无创诊断概念，同时结合最新的癌症领域研究成果，利用经典的分子生物学研究方法提出的一种新型辅助检测手段。利用该试剂盒进行检测时，只需抽取病人的8ml外周血，通过富集血液中的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,ctc)并对其特异性表达的maker基因进行实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测，通过marker基因表达量的高低判断甲状腺结节的良恶性，操作简单便捷，可重复性高，不需要专门的仪器设备和技术人员，避免了取样操作本身对检测结果的影响，同时避免组织穿刺对病人带来的生理和心理上的不适，最终展示的结果可以对甲状腺结节的良恶性进行明确判断，直观明了。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。