本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于微量法的6-磷酸葡萄糖含量测定试剂盒及方法。
背景技术：
6-磷酸葡萄糖（glucose6-phosphate，g6p）是糖代谢和糖异生途径的中间产物，广泛存在于动植物体和微生物中。但是，目前鲜有对6-磷酸葡萄糖的含量进行检测的文献报道，6-磷酸葡萄糖带有的磷酸根使得6-磷酸葡萄糖具有不稳定性，容易分解，因此现如今需要一种简单、快速、有效的方法对其含量进行检测。
技术实现要素：
为了满足上述需求，本发明旨在提供一种基于微量法的6-磷酸葡萄糖含量测定试剂盒及方法，具有操作简便，快捷有效，重复性好，准确度高等特点。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于微量法的6-磷酸葡萄糖含量测定试剂盒，包括以下试剂：
提取液，液体100ml×1瓶，由tris-hcl溶液组成，4℃保存；
试剂一，液体21ml×1瓶，由tris、mgcl2、水和浓盐酸混合而成，4℃保存；
试剂二，粉剂×1瓶，由6-磷酸葡萄糖脱氢酶（g6pdh）组成，-20℃保存；
试剂三，粉剂×1瓶，由nadp组成，-20℃保存。
进一步的，所述提取液中所含的tris-hcl溶液的ph为7.4，体积为100ml。
进一步的，所述试剂一中所含的tris的质量为0.254mg，mgcl2的质量为4.42mg，水的体积为21ml，浓盐酸的体积为22.1μl。
进一步的，所述试剂二中所含的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的质量为0.6mg。
进一步的，所述试剂三中所含的nadp的质量为42mg。
一种利用上述试剂盒的基于微量法的6-磷酸葡萄糖含量测定方法，测定原理为6-磷酸葡萄糖脱氢酶（g6pdh）可催化6-磷酸葡萄糖（g6p）和nadp+成nadph，在340nm下测定nadph增加速率可反映g6p含量的高低，该方法的具体步骤如下：
步骤1仪器和用品的准备；
准备酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水；
步骤26-磷酸葡萄糖样本的提取；
（1）细菌或培养细胞中提取：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例，超声波破碎，静置30min，采用离心率8000g，25℃离心10min，取上清待测。
（2）组织中提取：
按照组织质量（g）：提取液体积（ml）为1：5~10的比例（，进行冰浴匀浆，静置30min，采用离心率8000g，25℃离心10min，取上清待测；
（3）血清或血浆样品中提取：
按照血清或血浆体积（ml）：提取液体积（ml）为1：5~10的比例，进行冰浴匀浆，静置30min，采用离心率8000g，25℃离心10min，取上清待测；
步骤3试剂的配制；
（1）试剂二溶液的配制：
在0.6mg的所述试剂二中加入1ml所述试剂一，充分混匀溶解，制得试剂二溶液；
（2）工作液的配制：
取10μl上述配制好的试剂二溶液和42mg所述试剂三粉剂，一同加入到所述试剂一的容量瓶中，与瓶中剩余的所述试剂一充分溶解混合，制得工作液；
步骤46-磷酸葡萄糖含量的测定操作；
（1）酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
（2）取10μl提取到的所述6-磷酸葡萄糖样本和190μl配制好的所述工作液，一同加入96孔板，混匀后立即记录在340nm处的吸光值a1和5min后的吸光值a2，△a测定管=a2-a1；
步骤56-磷酸葡萄糖含量的计算；
标准条件下测定回归方程为y=0.0976x+0.004；
其中，x为6-磷酸葡萄糖的含量，单位为mg/ml，
y为吸光值△a测定管；
（1）按照细菌或细胞密度计算：
6-磷酸葡萄糖含量（mg/104cell）=[(a-0.004)÷0.0976×v1]÷（500×v1÷v2）=0.0205×(a-0.004)；
（2）按照样品质量计算；
6-磷酸葡萄糖含量（mg/g鲜重）=[(a-0.004)÷0.0976×v1]÷(w×v1÷v2）=10.24×(a-0.004)÷w；
（3）按照蛋白浓度计算
6-磷酸葡萄糖含量（mg/mgprot）=[(a-0.004)÷0.0976×v1]÷(v1×cpr)=10.24×(a-0.0675)÷cpr；
（4）按照血清（浆）体积计算：
6-磷酸葡萄糖含量（mg/ml）=[(a-0.004)÷0.0976×v1]÷（v3×v1÷v2）=102.4×(a-0.004)；
其中，v1=0.01ml，表示加入反应体系中样本的体积；
v2=1ml，表示加入的提取液的体积；
v3=0.1ml，表示加入血清或血浆的体积；
cpr表示样本蛋白质的浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数为500万。
进一步的，所述步骤2的（1）中，细菌或细胞数量（104个）：提取液（ml）的优选比例为500：1，即在500万细菌或细胞中加入1ml提取液。
进一步的，所述步骤2的（1）中，超声波破碎的具体方法为将加入所述提取液的细菌或细胞冰浴，采用功率为20％或200w，超声3s，间隔10s，重复30次。
进一步的，所述步骤2的（2）中，组织质量（g）：提取液体积（ml）的优选比例为1：10，即在0.1g组织中加入1ml提取液。
进一步的，所述步骤2的（3）中，血清或血浆体积（ml）：提取液体积（ml）的优选比例为1：10，即在0.1ml血清或血浆中加入1ml提取液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明的检测方法所采用的微量法测试快捷有效，可以防止因测试时间过长而可能导致的6-磷酸葡萄糖分解的问题。
2、本发明的检测方法的样本前处理过程简单易，而且测定的操作步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，每一个样品测试时间短。
3、本发明的检测方法重复性好，变异系数≤5%。
4、本发明的检测方法准确度高，加标回收率为98%-102%。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种基于微量法的6-磷酸葡萄糖含量测定试剂盒，包括以下试剂：
提取液，液体100ml×1瓶，由100ml，ph=7.4的tris-hcl溶液组成，4℃保存；
试剂一，液体21ml×1瓶，由0.254mgtris、4.42mgmgcl2、21ml水和22.1μl浓盐酸混合而成，4℃保存；
试剂二，粉剂×1瓶，由0.6mg6-磷酸葡萄糖脱氢酶（g6pdh）组成，-20℃保存；
试剂三，粉剂×1瓶，由42mgnadp组成，-20℃保存。
一种利用上述试剂盒的基于微量法的6-磷酸葡萄糖含量测定方法，测定原理为6-磷酸葡萄糖脱氢酶（g6pdh）可催化6-磷酸葡萄糖（g6p）和nadp+成nadph，在340nm下测定nadph增加速率可反映g6p含量的高低，该方法的具体步骤如下：
步骤1仪器和用品的准备；
准备酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水；
步骤26-磷酸葡萄糖样本的提取；
（1）细菌或培养细胞中提取：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200w，超声3s，间隔10s，重复30次），静置30min，采用离心率8000g，25℃离心10min，取上清待测。
（2）组织中提取：
按照组织质量（g）：提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，采用离心率8000g，25℃离心10min，取上清待测；
（3）血清或血浆样品中提取：
按照血清（浆）体积（ml）：提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取0.1ml血清（浆）加入1ml提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，采用离心率8000g，25℃离心10min，取上清待测；
步骤3试剂的配制；
（1）试剂二溶液的配制：
在0.6mg的所述试剂二中加入1ml所述试剂一，充分混匀溶解，制得试剂二溶液；
（2）工作液的配制：
取10μl上述配制好的试剂二溶液和42mg所述试剂三粉剂，一同加入到所述试剂一的容量瓶中，与瓶中剩余的所述试剂一充分溶解混合，制得工作液；
步骤46-磷酸葡萄糖含量的测定操作；
（1）酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
（2）取10μl提取到的所述6-磷酸葡萄糖样本和190μl配制好的所述工作液，一同加入96孔板，混匀后立即记录在340nm处的吸光值a1和5min后的吸光值a2，△a测定管=a2-a1；
步骤56-磷酸葡萄糖含量的计算；
标准条件下测定回归方程为y=0.0976x+0.004；
其中，x为6-磷酸葡萄糖的含量，单位为mg/ml，
y为吸光值△a测定管；
（1）按照细菌或细胞密度计算：
6-磷酸葡萄糖含量（mg/104cell）=[(a-0.004)÷0.0976×v1]÷（500×v1÷v2）=0.0205×(a-0.004)；
（2）按照样品质量计算；
6-磷酸葡萄糖含量（mg/g鲜重）=[(a-0.004)÷0.0976×v1]÷(w×v1÷v2）=10.24×(a-0.004)÷w；
（3）按照蛋白浓度计算
6-磷酸葡萄糖含量（mg/mgprot）=[(a-0.004)÷0.0976×v1]÷(v1×cpr)=10.24×(a-0.0675)÷cpr；
（4）按照血清（浆）体积计算：
6-磷酸葡萄糖含量（mg/ml）=[(a-0.004)÷0.0976×v1]÷（v3×v1÷v2）=102.4×(a-0.004)；
其中，v1=0.01ml，表示加入反应体系中样本的体积；
v2=1ml，表示加入的提取液的体积；
v3=0.1ml，表示加入血清或血浆的体积；
cpr表示样本蛋白质的浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数为500万。
经实验证明，本发明的检测方法测试快捷有效，可以防止因测试时间过长而可能导致的6-磷酸葡萄糖分解的问题，而且重复性好，变异系数≤5%，且准确度高，加标回收率为98%-102%。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。