本发明涉及一种食品中农药残留检测用稳定同位素标记腐霉利内标试剂的制备方法，属于食品安全检测用标准物质研发领域。
背景技术：
腐霉利(procymidone，casno.：32809-16-8)，内吸性杀真菌剂，对葡萄孢属和核盘菌属真菌有特效，能防治果树、蔬菜作物的灰霉病、菌核病，对苯丙咪唑产生抗性的真菌亦有效。主要是抑制菌体内甘油三酯的合成，具有保护和治疗的双重作用。腐霉利属于低毒性杀菌剂，少量农药残留不会导致急性中毒，但长期食用农药残留超标的蔬菜可能对人体健康产生一定的不良影响。目前我国的标准《gb2763-2016食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中已经规定了腐霉利的残留标准，并有相应的检测方法如《gb/t20769-2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》和《gb23200.71-2016食品安全国家标准食品中二缩甲酰亚胺类农药残留量的测定气相色谱-质谱法》，目前都是用外标法来进行检测，定量限和检出限都比较高，而采用稳定同位素标记腐霉利作为内标化合物的液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法能显著提高检测的灵敏度，降低该化合物的定量限和检出限。
本发明所涉及食品中农药残留检测用稳定同位素标记腐霉利的研制，能满足我国食品安全国家标准中关于农药残留限量的发展趋势。目前全球尚未发现有稳定同位素标记腐霉利的制备文献，因此，研制稳定同位素标记腐霉利对我国相关的食品安全监管检测工作具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种适用于食品中农药残留检测用稳定同位素标记腐霉利的制备方法。该发明制备路线短，反应条件简单，合成所需原料、中间体简单易得，产品质量能满足液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法所需内标试剂的技术要求。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种食品安全中农药残留检测用稳定同位素标记腐霉利内标试剂的制备方法，该稳定同位素标记腐霉利内标试剂的化学结构如式(i)所示：
其中，(i)中x为12c或13c，y为h或d，其合成步骤总路线为：
其中，x为12c或13c，y为h或d，r为甲基或乙基。
(1)在有机溶剂存在条件下，在氮气保护条件下，加入1,2-环丙烷二甲酸二酯，然后加入强碱性试剂，在-80℃～0℃条件下，反应0.5～6小时；无需处理，直接加入稳定同位素标记碘甲烷，在该温度下继续反应2～10小时，反应混合溶液用水淬灭，用酸调节ph值至酸性，水相用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸二酯；
(2)将步骤(1)得到的稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸二酯加入到无机碱的水溶液中，在10℃～100℃条件下，反应2～24小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应液用酸调节ph值至酸性，水相用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸；
(3)将步骤(2)所得稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸溶于有机溶剂中，在氮气保护下，加入酰基化试剂，在0℃～100℃条件下反应2～12小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去酰基化试剂，得到稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酰氯；
(4)在有机溶剂中加入3,5-二氯苯胺和催化剂，在-30℃～30℃条件下反应0.5～2小时；加入步骤(3)所得稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酰氯，在该温度下继续搅拌0.5～3小时，然后升温至室温反应12～24小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，分液，水相用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记腐霉利。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的食品中农药残留检测用稳定同位素标记腐霉利内标试剂的制备，方法所使用的制备路线短，反应条件简单温和，合成所需原料、中间体简单易得，产品质量能满足液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法所需内标试剂的技术要求。制备出的稳定同位素标记腐霉利纯度大于98％，同位素丰度大于99％。该化合物结构的制备路线及方法均未有文献报道，研制稳定同位素标记腐霉利内标试剂对食品安全监管中农药残留检测工作有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例进一步叙述本发明，但它并不是对本发明的范围的任何限制。
实施例1：1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸二酯-d6的制备
在100ml三口瓶中，在氮气保护下，加入1,2-环丙烷二甲酸二酯(1.58g，10mmol)和干燥的四氢呋喃(10ml)；降温至-15℃，加入二异丙基氨基锂的四氢呋喃溶液(2mol/l，30ml，60mmol)，并在该温度下搅拌反应1小时；在该温度下，继续加入氘代碘甲烷(5.8g，40mmol)，并在该温度下搅拌反应2小时；将该反应混合物升温至室温后，用水淬灭，用1mol/l的盐酸调节ph值至酸性，水相用乙酸乙酯萃取(3×50ml)，合并有机相，依次用水洗涤(3×50ml)，饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3×50ml)，饱和氯化钠溶液洗涤(3×50ml)，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸二酯-d6(1.44g，收率75％)。
实施例2：1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸-d6的制备
在100ml三口瓶中，加入1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸二甲酯-d6(1.15g，6mmol)和氢氧化钠水溶液(2.5mol/l，24ml，60mmol)，加热到80℃下反应12小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应液用1mol/l的盐酸调节ph值至酸性；水相用乙酸乙酯萃取(3×30ml)，合并有机相，依次用水洗涤(3×30ml)，饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3×30ml)，饱和氯化钠溶液洗涤(3×30ml)，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸-d6(0.82g，收率83％)。
实施例3：稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酰氯-d6的制备
在50ml三口瓶中，加入稳定1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酸-d6(0.49g，3mmol)和氯化亚砜(5ml)，升温至回流搅拌3小时，减压蒸馏除去过量的氯化亚砜，得稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酰氯-d6粗品(0.6g)。
实施例4：稳定同位素标记腐霉利-d6的制备
在25ml三口瓶中，加入3,5-二氯苯胺(0.2g，1.25mmol)、无水二氯甲烷(5ml)、催化剂三乙胺(0.52g，5mmol)，冷却至-10℃，加入稳定同位素标记1,2-二甲基-1,2-环丙烷二甲酰氯-d6粗品(0.5g，2.5mmol)，然后升温至室温，继续反应16小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应液用水淬灭，水相用二氯甲烷萃取(3×10ml)，合并有机相，依次用水洗涤(3×10ml)，饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3×10ml)，饱和氯化钠溶液洗涤(3×10ml)，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记腐霉利-d6(227mg，收率67％)；hnmr(dmso-d6，300m)δppm7.5～7.7(m，3h)，1.4(m，2h)，msesi+290[m+1]。
13c标记和d和13c双标记的6-苄基腺嘌呤合成步骤同上述实施例中稳定同位素标记腐霉利-d6的制备路线。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。