多环芳烃降解菌的筛选方法与流程

本发明属于微生物降解多环芳烃技术领域，更具体地，涉及一种多环芳烃降解菌的筛选方法。

背景技术：

多环芳烃(pahs)是指两个或两个以上苯环以链状、角状或串状排列组成的化合物，主要来自于木材、化石燃料、煤焦油产品或食物等有机质的不完全燃烧，多环芳烃在环境中分布广泛，在大气、水体、土壤、沉积物和食品中都有检出。其中许多种类具有致癌、致畸、致突变作用，而且其毒性和致癌性随着苯环数目的增加而增加。

环境中的多环芳烃除了少部分可以发生光化学分解以及被环境中的氧化剂氧化之外，大部分主要依赖生物降解途径逐渐消失，因此微生物降解是控制多环芳烃污染较为经济有效的方法。而多环芳烃降解菌的获取正是研究和利用微生物降解多环芳烃能力的基础。

目前常用的多环芳烃降解菌筛选方法是液体摇瓶培养法，其是在无机盐培养基中加入土壤等菌源，通过多次转接富集后进行多环芳烃降解菌的筛选。但是，这种方法由于四环及以上的多环芳烃的分子量大、疏水性强、水溶性低，因此，目前常用的摇瓶培养法仅适合于筛选三环及三环以下多环芳烃的降解菌，而对于四环及其以上多环芳烃的降解微生物的筛选，会出现周期长、筛出机率小，筛出的降解菌系稳定性差、降解率不高等问题。同时，由于多环芳烃降解菌生长速率较慢，因此经过多次转接之后会造成菌源中生长周期较长的多环芳烃降解菌丢失，最后导致富集出来的菌为不具备多环芳烃降解能力的多环芳烃耐受菌。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种多环芳烃降解菌的筛选方法，利用该方法筛选时间短，更易得到高效多环芳烃降解菌，尤其适合用于对降解速率较慢的四环及以上多环芳烃降解菌的筛选。

为了实现上述目的，本发明提供了一种多环芳烃降解菌的筛选方法，该筛选方法包括：

(1)向受多环芳烃污染的土壤中添加多环芳烃进行培养，得到培养后的土壤；

(2)将所述培养后的土壤重复步骤(1)；

(3)取步骤(2)所得的土壤用无菌水稀释，制备菌悬液；将所述菌悬液涂布于以多环芳烃为唯一碳源的双层培养基上进行培养，观察所述双层培养基上是否产生透明圈的菌落；

(4)如果所述双层培养基上未能产生透明圈的菌落，则重复步骤(1)和(3)；

(5)将所述菌落进行纯化，即得所述多环芳烃降解菌。

本发明的技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明在土壤中持续添加多环芳烃对土壤里的微生物菌群进行驯化，能够保证生长繁殖较慢的多环芳烃降解菌可以在同一驯化体系中生长起来，避免在传统摇瓶驯化转接过程中导致多环芳烃降解菌丢失的风险；

(2)本发明的在土壤中添加多环芳烃来对微生物菌群进行驯化与在传统摇瓶体系中添加多环芳烃驯化相比，土壤中多环芳烃经过拌和后的均匀性比在摇瓶体系中的均匀性好，对微生物菌群的驯化效果更好；

(3)本发明的方法克服了传统筛菌驯化方法过程中操作繁琐的特点，具有节省人工、操作方便的特点；

(4)本发明的方法与传统方法相比，大大缩短了多环芳烃降解菌的筛选时间，一般情况下对土壤驯化28天后进行筛选即可获得多环芳烃降解菌。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本发明示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。

图1示出了根据本发明的实施例1的多环芳烃降解菌的筛选方法得到的选择培养基平板上的透明圈的芘降解菌落。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。

本发明提供了一种多环芳烃降解菌的筛选方法，该筛选方法包括：

(1)向受多环芳烃污染的土壤中添加多环芳烃进行培养，得到培养后的土壤；

(2)将所述培养后的土壤重复步骤(1)；

(3)取步骤(2)所得的土壤用无菌水稀释，制备菌悬液；将所述菌悬液涂布于以多环芳烃为唯一碳源的双层培养基上进行培养，观察所述双层培养基上是否产生透明圈的菌落；

(4)如果所述双层培养基上未能产生透明圈的菌落，则重复步骤(1)和(3)；

(5)将所述菌落进行纯化，即得所述多环芳烃降解菌。

本发明的方法克服了传统方法中工作量大、降解菌容易丢失、降解菌获得率低等缺点。如果因添加多环芳烃驯化时间不够，可继续向土壤中添加多环芳烃继续驯化，无需重新开始驯化，与传统筛选方法相比，避免了重复工作量的发生和多环芳烃降解菌的丢失。

本发明通过将所述培养后的土壤重复步骤(1)，以土壤中微生物维持在多环芳烃的毒性胁迫下。

本发明的方法中的步骤(4)通过对已经经过多环芳烃驯化的微生物菌群继续驯化，从而继续提高微生物菌群中多环芳烃降解菌的丰度。

根据本发明，优选地，所述多环芳烃为菲、芘、蒽、荧蒽和苯并(a)芘中的至少一种。

根据本发明，优选地，步骤(1)包括：向部分受多环芳烃污染的土壤中添加多环芳烃溶液，待溶剂挥发后，与剩余受多环芳烃污染的土壤混合均匀，进行培养。

本发明中，待溶剂挥发后挥发完后再与剩余受多环芳烃污染的土壤进行混合，防止溶剂的添加对土壤中微生物菌群产生危害。

根据本发明，优选地，所述多环芳烃溶液为多环芳烃的丙酮溶液。

根据本发明，优选地，步骤(1)中，所述培养的温度为25-35℃，培养的时间为14-28d，以受多环芳烃污染的土壤的重量计，所述多环芳烃的添加浓度为400-500mg/kg。土壤含水量调节为土壤的田间持水量。

根据本发明，优选地，步骤(3)中，所述稀释的倍数为10³-10⁵倍；所述培养的温度为25-35℃，培养的时间为7-14d。

作为优选方案，步骤(3)为取步骤(2)所得的土壤与无菌水混合、振动、静置，取上清液；将所述上清液用无菌水稀释，制备菌悬液；将所述菌悬液涂布于以多环芳烃为唯一碳源的双层培养基上进行培养，观察所述双层培养基上是否产生透明圈的菌落。

根据本发明，优选地，所述以多环芳烃为唯一碳源的双层培养基为固体培养基，上层为含唯一碳源多环芳烃的无机盐培养基，下层为不含碳源的无机盐培养基。

本发明的以多环芳烃为唯一碳源的双层培养基的制备方法为：将高温灭菌过的无机盐培养基溶液倾倒于无菌培养皿中，固化形成下层培养基；将经高温灭菌的的无机盐培养基溶液与多环芳烃溶液混合后吸取一定量均匀涂布于冷却的下层培养基上，使多环芳烃均匀分布在培养基上，形成上层培养基。

根据本发明，优选地，以1l的所述无机盐培养基的溶液计，所述溶液包括：(nh4)2so42-4g，kh2po40.3-0.7g，na2hpo40.3-0.7g，mgso40.2-0.5g，微量元素溶液0.5-1.5ml，琼脂10-20g用5mol/l的naoh溶液调节ph为6-7，余量为无菌蒸馏水；以1l的所述微量元素溶液计，所述微量元素溶液包括：fecl30.1-0.5g，feso4·7h2o0.1-0.5g，mnso4·h2o0.1-0.2g，znso40.1-0.2g，cocl20.1-0.3g，余量为无菌蒸馏水。

根据本发明，优选地，所述以多环芳烃为唯一碳源的双层培养基的上层培养基中多环芳烃浓度为400-500mg/l。

根据本发明，优选地，所述纯化的方法包括：将所述能产生透明圈的菌落在新的以多环芳烃为唯一碳源的双层培养基上划线分离。

以下通过实施例进一步说明本发明：

实施例1

本实施例提供一种多环芳烃降解菌的筛选方法，该筛选方法如下：

(1)菌源的获取：采集某焦化厂周围受多环芳烃污染的土壤，过2mm筛，立即置于4℃冰箱内保存备用；

(2)芘降解菌富集：取50g多环芳烃污染土壤于1l无菌烧杯中培养，30℃条件下活化24小时；土壤活化后取10g土壤，添加4ml浓度为5000mg/l的芘丙酮溶液；1小时后丙酮挥发完全，将添加了多环芳烃的10g土壤与剩余40g土壤搅拌均匀，使土壤中芘的初始浓度为400mg/kg，将土壤转移到150ml锥形瓶中，置于30℃培养箱中静置培养14天；14天后培养过的土壤继续添加5000mg/l的芘丙酮溶液4ml，在30℃培养箱中继续静置培养14天；

(3)选择培养基配制方法如下：

下层的制备方法：将无机盐培养基的溶液，高温蒸气灭菌，在无机培养基溶液凝固前倒入培养皿中，冷却后备用。其中，无机盐培养基的溶液的配制为：将(nh4)2so43g，kh2po40.5g，na2hpo40.5g，mgso40.3g，微量元素溶液1ml，ph＝7.0和琼脂15g混合均匀，加无菌蒸馏水定容至1000ml，用5mnaoh溶液调培养基ph＝6.5。微量元素溶液的配制为：将fecl30.3g，feso4·7h2o0.3g，mnso4·h2o0.15g，znso40.14g和cocl20.2g混合均匀，加无菌蒸馏水定容至1000ml。

上层的配制方法：将无机盐培养基溶液，高温蒸汽灭菌，灭菌后加入5000mg/l芘的丙酮溶液，与无机培养基溶液混匀，使无机培养基溶液的终浓度达到500mg/l，用移液枪吸取5ml未凝固的培养基混合溶液均匀涂布在下层无机盐培养基上，冷却后备用。

(4)芘降解菌筛选：取培养了28天的土壤5g与45g无菌水于250ml无菌锥形瓶内，在转速为150rpm的恒温振荡器中振荡2小时，随后取出锥形瓶，静置30分钟，将上清液在无菌条件下进行10倍系列梯度稀释至10^-5，制备菌悬液；分别取10^-3，10^-4和10^-5三个浓度的菌悬液100μl涂布在以芘为唯一碳源的双层培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养1-2周，观察选择培养基平板上降解菌透明圈的生成情况。两周后可在选择培养基(以芘为唯一碳源的双层培养基)上观察到能产生透明圈的菌落(如图1所示)。

(6)芘降解菌纯化：挑取能在选择培养基平板上产生透明圈的菌落，在新的选择培养基平板(以芘为唯一碳源的双层培养基)上利用三线法划线纯化。重复上述划线步骤，直到选择培养基平板上菌落形态单一无杂菌。最后得到两株形态不同的芘降解菌。

芘降解菌鉴定和保存：对上述方法得到的两株芘降解菌分别进行16srrna基因序列测定和系统发育分析。结果显示两株芘降解菌分别是分枝杆菌属(mycobacteriumsp.)和假诺卡氏菌属(pseudonocardiasp.)。将两株菌用冻干法进行保存。

实施例2

(1)菌源的获取：本实施例的菌源来自于辽宁某化工厂多环芳烃污染土壤。

(2)降解菌富集：本实施例通过在污染土壤中分别添加芘和荧蒽来对土壤中的微生物进行富集。芘和荧蒽的添加方法与实施例1中相同，添加芘和荧蒽后，两个驯化体系土壤中芘和荧蒽的初始浓度均为500mg/kg。将两个驯化体系放置于30℃恒温培养箱中培养14天，分别继续向土壤中添加芘和荧蒽，使添加后土壤中芘和荧蒽的浓度增加500mg/kg，添加方法同实施例1。

(3)选择培养基的配制方法同实施例1。

(4)降解菌的筛选方法同实施例1。选择培养基在培养箱中培养至第四周均未观察到降解透明圈的生成。

(5)重复步骤(2)和(4)，14天后发现芘和荧蒽选择培养基上均产生了大量透明圈，说明含有芘和荧蒽的选择培养基上筛选出了大量芘和荧蒽的降解菌。

(6)降解菌的纯化和鉴定方法与实施例1中的方法相同；

最后通过16srrna基因序列鉴定发现芘和荧蒽的降解菌为同一种菌，属于分枝杆菌属(mycobacteriumsp.)。通过研究该菌对芘和荧蒽的降解能力发现，该菌在仅含有芘和荧蒽的无机培养基中培养14天，对100mg/l的芘和荧蒽降解率分别为73.2％和89.5％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别为：采用某钢铁厂多环芳烃污染土壤作为降解菌的来源，以污染物为500mg/kg浓度的菲对菌源进行驯化，其他筛选步骤和工艺参数均与实施例1相同。

在以菲为唯一碳源的培养基上获得了能够产生降解圈的菌，可确认其为多环芳烃菲的降解菌，通过16srrna基因序列测定和系统发育分析，可初步确定获得的菲降解菌为红球菌属(rhodochroussp.)。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。