可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体及其构建方法、应用与流程

本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体及其构建方法、应用。

背景技术：

乳酸菌(lacticacidbacteria,lab)是一群能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰阳性细菌,是人和大多数动物肠道内的常见细菌,安全无毒素，被公认为安全级(generalyrecoassafe,gras)微生物。乳酸菌载体口服疫苗作用于粘膜系统的具体机制在于粘附于机体粘膜上可以在粘膜部位持续不断的合成和释放抗原蛋白，可以刺激产生特异性分泌型iga，且刺激产生的iga抗体效价比直接注射纯化的抗原蛋白产生的抗体效价高。也有研究表明，乳酸菌载体疫苗通过鼻饲免疫而诱发抗体特异性的细胞免疫，检测到th1细胞因子（th1cytokines）、白介素-2（il-2）和干扰素-γ（ifn-γ）的表达量的变化。使用乳酸菌载体疫苗抗癌细胞生长，主要通过cd4+和cd8+依赖的tc细胞反应途径。

外源蛋白在乳酸菌载体中的高效表达的调节可通过组成型和诱导型的启动子来实验，组成型表达的乳酸菌表达系统，外源蛋白可以利用乳酸菌的蛋白表达系统持续的表达，而诱导型的则需要诱导物、抑制物活环境因子的诱导才能实现大量表达。利用乳酸菌蛋白表达系统，在乳酸菌表达载体中插入蛋白分泌系统中的信号肽，可以实现外源蛋白在乳酸菌表面或胞外的表达分泌，满足不同的实验要求。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体；

本发明还提供了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的构建方法；

本发明还提供了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体，其包括氨苄抗性基因序列大肠杆菌复制子ori、大肠杆菌组成型启动子p32、乳酸菌分泌信号肽usp45、多克隆位点及大肠杆菌不耐热性肠毒素ltb基因序列。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体还包括氨苄抗性基因序列。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体还包括pbr322复制子。

作为优选，大肠杆菌组成型启动子p32和乳酸菌分泌信号肽usp45后存在多克隆位点。

作为优选，大肠杆菌不耐热性肠毒素ltb基因序列位于多克隆位点后。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体位于大肠杆菌dh5α中。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体通过电击转化的方式存在于干酪乳杆菌中。

一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的构建方法包括以下步骤：

依次制备获得氨苄抗性基因序列大肠杆菌组成型启动子p32、乳酸菌分泌信号肽usp45、多克隆位点、大肠杆菌不耐热性肠毒素ltb基因序列获得可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体可应用于在大肠杆菌中筛选乳酸菌表达载体外源基因重组子。

8149是一个食品级的乳球菌载体，但它需要体外重组后转入乳酸菌中筛选，难度非常大，因此需要改造，改造的目的是加一个能在大肠杆菌中复制的复制子以及一个抗性基因，并在这个加入的片段两端加一下酶切位点，这样，可以在大肠杆菌中进行克隆筛选，然后再用酶切去加入的序列，形成粘性未端，转入到乳球菌中互连，形成转化子。

因此，本发明具有以下有益效果：通过本发明中的可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的构建方法能够获得一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型疫苗载体。

附图说明

图1为pnzes8149-degq转化大肠杆菌结果图；

图2为pnzes8149-degq转化大肠杆菌后菌落pcr验证结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明中，若非特指，所有的设备和原料均可从市场上购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

本发明实施例中使用omegabio-tek(ga)的试剂盒进行质粒抽提、基因组dna的提取、从琼脂糖凝胶中回收dna片段和pcr产物的纯化，操作方法依照说明书进行。ta克隆载体peasy-t1simple从全式金生物技术有限公司购买。高保真dna聚合酶、t4dna连接酶、dl2000marker、dl5000marker、限制性内切酶、rt-pcrkit均购自fermentas公司。引物由上海生工生物有限公司合成，其余实验所用试剂均为国产分析纯。

实施例1可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体pnzes8149的构建

1.1ppic9k中的amp与pbr322序列的克隆

以质粒ppic9k为模板，使用引物apf1(5’-gtcgacatgagtattcaacatttccgtgt-3’，seqidno.1，划线碱基为salⅰ酶切位点)和apr1(5’-gtcgaccgcgttgctggcgttttt-3’，seqidno.2，划线碱基为salⅰ酶切位点)为引物进行pcr扩增，获得amp与pbr322序列（seqidno.5）。pcr条件为：94℃5min预变性模板dna,然后94℃30s，58℃1min，72℃1min，5个循环后调整为94℃30s，68℃1min，72℃1min，25个循环后72℃延伸10min；将pcr产物纯化后与载体peasy-simple-t1室温连接10分钟，将混合液转化至大肠杆菌dh5α中，在含有100μg/ml氨苄青霉素、40μg/mlx-gal和24μg/ml异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的lb固体培养基上培养16小时后采用pcr扩增的手段筛选阳性克隆，测序验证，获得重组质粒peasyap。

1.2可在大肠杆菌中复制的乳酸菌载体的构建

使用salⅰ限制性内切酶37℃条件下分别酶切质粒pnz8149和peasyap后，胶回收纯化目的片段；使用t4连接酶连接，将amp与pbr322序列插入pnz8149质粒中，热激转化至大肠杆菌dh5α中，在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基上培养16小时后采用pcr扩增的手段筛选阳性克隆，测序验证，获得重组质粒pnzamp8149。

1.3p32启动子、usp45和ltb序列的获得

根据pmg36e质粒图谱获得p32序列，根据genebank公布的usp45和ltb序列设计合成含有这三个基因的序列，该融合基因序列（seqidno.6）两端含有ncoⅰ限制性内切酶酶切位点，usp45和ltb序列之间包含bamhⅰ和ecorⅴ酶切位点。

1.4可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体pnzaes8149的构建

将前述融合基因序列和质粒pnzamp8149分别用ncoⅰ限制性内切酶37℃条件下，酶切并胶回收目的片段。使用t4连接酶，将前述融合基因序列与质粒pnzamp8149进行连接，热激转化至大肠杆菌dh5α中，在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基上培养16小时后采用pcr扩增的手段筛选阳性克隆，测序验证，获得重组质粒pnzes8149。

实施例2含有嗜水气单胞菌degq基因的乳酸菌分泌型载体在大肠杆菌中的筛选

2.1嗜水气单胞菌degq基因的克隆

根据genebank公布的嗜水气单胞菌degq基因序列（seqidno.7），采用引物degqf1（5’-ggatccatgcgtaaacctctttctgt-3’，seqidno.3，划线碱基为bamhⅰ酶切位点）和degqr1（5’-cccgggacggatcaccagatagagg-3’，seqidno.4，划线碱基为ecorⅴ酶切位点），以嗜水气单胞菌基因组为模板克隆获得degq基因，并连接至peasy-simple-t1，热激转化至获得大肠杆菌dh5α中，在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基上培养16小时后采用pcr扩增的手段筛选阳性克隆，测序验证，获得重组质粒peasy/degq。

2.2pnzes8149-degq的构建

使用限制性内切酶分别酶切质粒pnzes8149和peasy/degq，回收获得目的片段，t4连接酶连接，热激转化至获得大肠杆菌dh5α中，在含有100μg/ml氨苄青霉素、40μg/mlx-gal和24μg/ml异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的lb固体培养基上培养16小时后采用pcr扩增的手段筛选阳性克隆，测序验证，获得重组质粒pnzes8149-degq，检测结果如图1,2所示。

应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110>杭州师范大学

<120>可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体及其构建方法、应用

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