本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂及其制备方法和使用方法。
背景技术：
植物乳杆菌st-iii对人体有着巨大的益生作用，如调节血脂、降低胆固醇、粘附肠道上皮细胞等功能，植物乳杆菌st-iii的全基因组于2010年测定，并在实际生产中得到广泛应用。然而，将植物乳杆菌st-iii添加到牛乳中培养，生物量很低，几乎没有生长，原因可能是无法利用牛乳自主合成某些必须营养物质。前期研究发现类芽孢杆菌cgmccno.8333发酵制备的上清液对植物乳杆菌st-iii在乳中的生长具有显著促进作用，但存在发酵时间过长的问题，发酵16h，牛乳ph从6.6降至5.3。常规的类芽孢杆菌cgmccno.8333上清液浓缩方法，如加热或离心，对本专利得增殖剂效果都不理想，促进效果不明显，因为增殖剂中含有大量乳糖，加热或离心无法将乳糖有效结晶或分离出来，无法实现有效浓缩。因此通过一定手段提高增殖剂浓度以便能够大幅缩减st-iii的发酵时间具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂及其制备方法和使用方法，以及该增值剂对植物乳杆菌st-iii的使用方法，该增值剂及使用方法对植物乳杆菌st-iii在乳中的生长具有显著的促进作用。
本发明为达到上述目的，具体通过以下技术方案得以实现的：
一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)扩培：将类芽孢杆菌cgmccno.8333种子液以体积百分比为3％的比例接种于10％脱脂乳培养基，在温度为25～30℃，摇床转速为150～200rpm/min的条件下培养96～144h，获得纯培养物；
(2)离心：将步骤(1)所得纯培养物于4～15℃，以转速5000～10000rpm离心，离心时间5～10min，取上清液；
(3)过柱：将步骤(2)所得的上清液进行固相萃取过柱，流动相为20％～60％的甲醇溶液，收集流出液；
(4)蒸发：将步骤(3)所收集的流出液进行蒸发，析出的物质即为高度浓缩植物乳杆菌增殖剂。
作为上述制备方法的进一步优化，步骤(1)中培养的时间为120～144h。
作为上述制备方法的进一步优化，步骤(2)中离心的转速为6000～9000rpm/min。
作为上述制备方法的进一步优化，步骤(3)中甲醇溶液的浓度为20～40％。
作为上述制备方法的进一步优化，步骤(4)中的蒸发为旋转蒸发或平行蒸发，蒸发加热温度为40～60℃，蒸发时间为1.5～3h。
本发明的一种利用上述任一的制备方法制得的高度浓缩植物乳杆菌增殖剂。
本发明的一种上述高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法，包括以下步骤：
(1)将所述高度浓缩植物乳杆菌增殖剂溶于水中，浓度为1％，获得增殖剂溶液；
(2)将步骤(1)所得的增殖剂溶液以1:4的比例加入至原料乳中，混合均匀，在温度118～121℃条件下灭菌处理15～20min，冷却至室温，获得培养乳；
(3)将植物乳杆菌种子液以体积百分比为1％～2％的比例接种至步骤(2)所得培养乳中，混合均匀，静置培养即可。
作为上述高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法的进一步优化，原料乳为生牛乳、脱脂牛乳和复原乳中的任意一种。
作为上述高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法的进一步优化，步骤(3)中植物乳杆菌种子液是将植物乳杆菌st-iii纯培养物以1％～2％(v/v)比例接种至mrs培养基，静置培养获得。
作为上述高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法的进一步优化，mrs培养基由以下组分组成：蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、葡萄糖20.0g/l、吐温801.0ml/l、乙酸钠5.0g/l、k2hpo4·3h2o2.0g/l、mgso4·7h2o0.58g/l、mnso4·h2o0.25g/l、琼脂18.0g/l及蒸馏水1l；mrs培养基的ph为6.2～6.6。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供的浓缩增殖剂制备方法简单，设备要求低，成本低廉；(2)进行固相萃取过柱，将增殖剂进行高度浓缩，此过程时间短，5min左右即可完成，易于操作，所得的增殖剂能够大幅度缩短st-iii的生长时间，从原来的24h降低至8～12h；(3)本发明制备的浓缩增殖剂对植物乳杆菌st-iii在乳中的生长具有显著促进作用，极大的提高了st-iii在实际产品开发中的应用潜力。
生物材料保藏信息
本发明中的类芽孢杆菌为类芽孢杆菌bd3526，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌种的保藏编号为：cgmccno.8333。该菌种的分类命名是类芽孢杆菌paenibacillussp.，名称为bd3526。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的制备方法，包括以下步骤：(1)扩培：将类芽孢杆菌cgmccno.8333种子液以体积百分比为3％的比例接种于10％脱脂乳培养基，在温度为25～30℃，摇床转速为150～200rpm/min的条件下培养96～144h，获得纯培养物；(2)离心：将步骤(1)所得纯培养物于4～15℃，以转速5000～10000rpm离心，离心时间5～10min，取上清液；(3)过柱：将步骤(2)所得的上清液进行固相萃取过柱，流动相为20％～60％的甲醇溶液，收集流出液；(4)蒸发：将步骤(3)所收集的流出液进行蒸发，析出的物质即为高度浓缩植物乳杆菌增殖剂。
作为上述制备方法的进一步优化，步骤(1)中培养的时间为120～144h。步骤(1)脱脂乳培养基为常规的脱脂乳培养基，将脱脂乳粉(购自恒天然商贸(上海)有限公司的)溶解于水中混合即得，百分比为脱脂乳粉占脱脂乳粉和水总质量的质量百分比。培养时间较佳的为96～168h，更佳地为120～144小时，最佳的为120小时。
步骤(2)中离心温度更佳地为5～10℃，最佳的为10℃；离心转速更佳的为6000-9000rpm/min，最佳的为8000rpm/min。
步骤(3)中固相萃取柱为waterssep-pakc18柱。甲醇溶液的浓度为20～40％。
步骤(4)中的蒸发为旋转蒸发或平行蒸发，蒸发加热温度为40～60℃，更佳的为45～55℃，蒸发时间为1.5～3h，更加的为2h。
本发明的一种利用上述任一的制备方法制得的高度浓缩植物乳杆菌增殖剂。
本发明的一种上述高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法，包括以下步骤：(1)将所述高度浓缩植物乳杆菌增殖剂溶于水中，浓度为1％，获得增殖剂溶液；(2)将步骤(1)所得的增殖剂溶液以1:4的比例加入至原料乳中，混合均匀，在温度118～121℃条件下灭菌处理15～20min，冷却至室温，获得培养乳；(3)将植物乳杆菌种子液以体积百分比为1％～2％的比例接种至步骤(2)所得培养乳中，混合均匀，静置培养即可。
原料乳为本领域常规，较佳的为生牛乳、脱脂牛乳和复原乳中的任意一种。植物乳杆菌种子液是将植物乳杆菌st-iii纯培养物以1％～2％(v/v)比例接种至mrs培养基，静置培养获得。
在符合本领域常识的基础上，上述的各优选条件可任意组合，即得本发明各较佳实例。
实施例1
一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)扩培：将类芽孢杆菌cgmccno.8333种子液按3％(v/v)接种于10％脱脂乳培养基；温度30℃、摇床转速180rpm/min条件下培养120h；
(2)离心：将步骤(1)所得纯培养物于10℃，转速8000rpm条件下离心10min，取上清液；
(3)过柱：将步骤(2)所得的上清液进行固相萃取过柱，流动相为20％的甲醇溶液，收集流出液；
(4)蒸发：将步骤(3)所收集的流出液进行平行蒸发，温度45℃，时间2h，析出的物质即为本发明提供的能够促进植物乳杆菌st-iii生长的高度浓缩增殖剂。
实施例2
一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)扩培：将类芽孢杆菌cgmccno.8333种子液按3％(v/v)接种于10％脱脂乳培养基；温度30℃、摇床转速180rpm/min的条件下培养144h；
(2)离心：将步骤(1)所得纯培养物于温度10℃、转速10000rpm条件下离心5min，取上清液；
(3)过柱：将步骤(2)所得的发酵上清液进行固相萃取过柱，流动相为60％的甲醇溶液，收集流出液；
(4)蒸发：将步骤(3)所收集的流出液进行旋转蒸发，温度50℃，时间2h，析出的物质即为能够促进植物乳杆菌st-iii生长的高度浓缩增殖剂。
实施例3
一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)扩培：将类芽孢杆菌cgmccno.8333种子液按3％(v/v)接种于10％脱脂乳培养基；温度30℃、摇床转速180rpm/min条件下培养132h；
(2)离心：将步骤(1)所得纯培养物于温度4℃、转速10000rpm条件下离心10min，取上清液；
(3)过柱：将步骤(2)所得的发酵上清液进行固相萃取过柱，流动相为40％的甲醇溶液，收集流出液；
(4)蒸发：将步骤(3)所收集的流出液进行平行蒸发，温度50℃，时间2h，析出的物质即为能够促进植物乳杆菌st-iii生长的高度浓缩增殖剂。
实施例4
一种利用上述实施例1制得的高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法，其对植物乳杆菌st-iii在乳中的促生长作用，其具体包括如下步骤：
(1)植物乳杆菌st-iii种子液的制备：无菌操作将st-iii纯培养物以2％(v/v)比例接种至mrs培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取实施例1制备的增殖剂溶于水中，浓度为1％，获得增殖剂溶液；取1ml增殖剂溶液加入至4ml生牛乳中，混合均匀，在温度118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温，获得培养乳；
(3)将步骤(1)制备的植物乳杆菌种子液以2％(v/v)比例接种至步骤(2)所得的培养乳中，混合均匀，静置培养即可。35℃静置培养12h后，牛乳出现凝乳现象。
其中，步骤(1)的mrs培养基为本领域常规培养基，由以下组分组成：蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、葡萄糖20.0g/l、吐温801.0ml/l、乙酸钠5.0g/l、k2hpo4·3h2o2.0g/l、mgso4·7h2o0.58g/l、mnso4·h2o0.25g/l、琼脂18.0g/l、蒸馏水1l；mrs培养基的ph为6.2～6.6。
实施例5
一种利用上述实施例2制得的高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法，其对植物乳杆菌st-iii在乳中的促生长作用，其具体包括如下步骤：
(1)植物乳杆菌st-iii种子液的制备：无菌操作将st-iii纯培养物以2％(v/v)比例接种至mrs培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取实施例2制备的增殖剂溶于水中，浓度为1％，获得增殖剂溶液；取1ml增殖剂溶液加入至4ml生牛乳中，混合均匀，在温度118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温，获得培养乳；
(3)将步骤(1)制备的植物乳杆菌st-iii种子液以1％(v/v)比例接种步骤(2)所述的培养乳中，混合均匀，静置培养即可。35℃静置培养12h后，牛乳出现凝乳现象。
实施例6
一种利用上述实施例3制得的高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法，其对植物乳杆菌st-iii在乳中的促生长作用，其具体包括如下步骤：
(1)植物乳杆菌st-iii种子液的制备：无菌操作将st-iii纯培养物以2％(v/v)比例接种至mrs培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取实施例3制备的增殖剂溶于水中，浓度为1％，获得增殖剂溶液；取1ml增殖剂溶液加入至4ml脱脂牛乳中，混合均匀，在温度118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温，获得培养乳；
(3)将步骤(1)制备的植物乳杆菌st-iii种子液以2％(v/v)比例接种步骤(2)所述的培养乳中，35℃静置培养12h，牛乳出现凝乳现象。
实施例7
一种利用上述实施例3制得的高度浓缩植物乳杆菌增殖剂的使用方法，其对植物乳杆菌st-iii在乳中的促生长作用，其具体包括如下步骤：
(1)植物乳杆菌st-iii种子液的制备：无菌操作将st-iii纯培养物以2％(v/v)比例接种至mrs培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取实施例3制备的增殖剂溶于水中，浓度为1％，获得增殖剂溶液；取1ml增殖剂溶液加入至4ml复原乳中，混合均匀，在温度118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温，获得培养乳；
(3)将步骤(1)制备的植物乳杆菌st-iii种子液以2％(v/v)比例接种步骤(2)所述的培养乳中，35℃静置培养12h，牛乳出现凝乳现象。
对比例1
(1)植物乳杆菌st-iii种子液的制备：无菌操作将st-iii纯培养物以2％(v/v)比例接种至mrs培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取4ml生牛乳，1ml去离子水，充分混匀，温度118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温，获得培养乳；
(3)将步骤(1)制备的植物乳杆菌st-iii种子液以2％(v/v)比例接种步骤(2)所述的培养乳中，静止培养。35℃静置培养24h，牛乳未出现凝乳现象。
对比例2
(1)植物乳杆菌st-iii种子液的制备：无菌操作将st-iii纯培养物以2％(v/v)比例接种至mrs培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取4ml生牛乳，取实施例1中步骤(2)所述的上清液1ml，充分混匀，温度118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温，获得培养乳；
(3)将步骤(1)制备的植物乳杆菌st-iii种子液以2％(v/v)比例接种步骤(2)所述的培养乳中，静置培养。35℃静置培养12h，牛乳未出现凝乳现象；静置培养24h，牛乳出现凝乳现象。
对比例3
(1)植物乳杆菌st-iii种子液的制备：无菌操作将st-iii纯培养物以2％(v/v)比例接种至mrs培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取实施例1中步骤(2)所述的上清液1ml，充分混匀，100℃，60min加热处理，冷却至室温，离心去除乳糖，取上清液1ml添加至4ml生牛乳；
(3)将步骤(1)制备的植物乳杆菌st-iii种子液以2％(v/v)比例接种步骤(2)所述的生牛乳中，静置培养。35℃静置培养12h，牛乳未出现凝乳现象；静置培养24h，牛乳出现凝乳现象。
对比例4
(1)植物乳杆菌st-iii种子液的制备：无菌操作将st-iii纯培养物以2％(v/v)比例接种至mrs培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取实施例1中步骤(2)所述的上清液1ml，充分混匀，10000rpm，30min离心处理，去除菌体蛋白和乳糖，取上清液1ml添加至4ml生牛乳；
(3)将步骤(1)制备的种子液以2％(v/v)比例接种步骤(2)所述的生牛乳中，静置培养。35℃静置培养12h，牛乳未出现凝乳现象；静置培养24h，牛乳出现凝乳现象。
效果实施例
采用ph计测定乳培养液ph值；观察培养过程中培养基凝乳情况；利用mrs平板倾注法对乳培养基中的st-iii菌落计数，单位为logcfu/ml。结果如表1所示：
表1
由表1可知，如实施例4中，添加本专利所述的高度浓缩增殖剂后，能够显著促进植物乳杆菌st-iii在牛乳基质中的生长，ph值从6.56降低至5.28，牛乳发生凝乳现象，极大提高了植物乳杆菌st-iii的生物量，潜在的增强了其应用范围。
本发明中的具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。