植物抗病相关基因RLK902及其应用的制作方法

本发明涉及到植物抗病相关基因rlk902及其应用。通过edr4相互作用蛋白的筛选，我们找到了一个亮氨酸富集的受体类蛋白激酶，这个激酶由rlk902基因编码，当rlk902基因的缺失突变以及表达量受到抑制时，植物对丁香假单胞杆菌的抗病性显著降低，而提高rlk902的基因表达水平可以增强植物对丁香假单胞杆菌的抗病性并促进了植物体内抗病相关基因的表达，属于基因工程领域。

背景技术：

细菌性病原菌是一类重要的植物病害，病原细菌多为杆状菌，主要包括五个属：假单胞杆菌属（pseudomonas）、黄单胞杆菌属(xanthomonas)、欧氏杆菌属(erwinia)、野杆菌属(agrobacterium)和棒杆菌属（corynebacterium）。它们大多具有一条或数条鞭毛，可以通过自然孔洞(气孔、皮孔、水孔)或伤口入侵植物，并通过雨水、介体昆虫等媒介传播。侵染植物后，会造成植物叶片萎蔫甚至坏死和腐烂。细菌性病原菌可以侵染多种经济作物，造成巨大的经济损失，如黄单胞杆菌属侵染水稻可以造成白叶枯病害，欧式杆菌属诱发的结球甘蓝软腐病，棒杆菌属侵染番茄造成的细菌性溃疡等等。细菌性病原菌的防治一般会通过种苗药物消毒、防治介体昆虫以及创制抗病品种来实现，研究挖掘更多的抗病相关基因及其抗病机理，可以为抗病品种的选育提供基因资源和理论基础。

在病原菌入侵植物时，植物会通过天然免疫系统来抵御病原菌的入侵。植物基础抗性是植物天然免疫系统的重要组成部分。基础抗性是通过位于细胞膜上的模式受体基础抗性通过位于细胞膜上的模式受体（patternrecognitionreceptor,prr）识别病原菌相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,pamps)，通过受体复合体的形成与激活，并依赖细胞内信号传递所引起的免疫反应，也称为pamps诱导的免疫反应（pampstriggeredimmunity,pti），是防卫反应的第一层次。植物中的受体类激酶（receptorlikekinases,rlks）是模式受体复合体成员中最主要的一类蛋白，这类蛋白可以直接参与病原菌相关分子模式的识别与早期免疫反应的激活。

前期的研究发现，拟南芥edr4蛋白参与了植物抗病相关蛋白的囊泡运输过程，通过研究edr4在拟南芥中的互作蛋白，可以挖掘更多的参与植物免疫调控因子。我们通过萤火素酶互补成像实验，免疫共沉淀等多种方法确定了一个由receptorlikekinase902（rlk902）编码的受体类激酶与edr4在植物中存在相互作用。rlk902突变后，拟南芥对于丁香假单胞杆菌的抗病性减弱，而通过转基因提高rlk902的基因表达水平可以显著增强植物对丁香假单胞杆菌的抗病性。我们以拟南芥与丁香假单胞杆菌为研究体系，通过对rlk902的功能分析，首次发现该基因对植物对细菌性病原菌的抗病反应具有重要的作用。我们的结果表明rlk902是创建抗病性增强的转基因作物和作物分子设计的优良候选基因，具有重要的理论价值和广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供植物抗病相关基因rlk902及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1.一个拟南芥抗病基因rlk902的序列，cds全长1944bp。其cds序列如seqidno.1所示。

2.rlk902蛋白序列，编码647个氨基酸，大小70.41kd。其氨基酸序列如seqidno.2所示。

3.rlk902突变之后降低了拟南芥对丁香假单胞杆菌的抗病性，而提高rlk902的基因表达水平可以显著增强植物对丁香假单胞杆菌的抗病性。

4.可以通过基因工程技术，通过提高rlk902基因表达水平来改良作物的抗病性状。

本发明的优点在于：

申请人通过萤火素酶互补成像实验，免疫共沉淀等多种方法确定了一个由receptorlikekinase902（rlk902）编码的受体类激酶与edr4在植物中存在相互作用。rlk902突变后，拟南芥对于丁香假单胞杆菌的抗病性减弱，而通过转基因提高rlk902的基因表达水平可以显著增强植物对丁香假单胞杆菌的抗病性。我们以拟南芥与丁香假单胞杆菌为研究体系，通过对rlk902的功能分析，首次发现该基因对植物对细菌性病原菌的抗病反应具有重要的作用。我们的结果表明rlk902是创建抗病性增强的转基因作物和作物分子设计的优良候选基因，具有重要的理论价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1.为检测rlk902与edr4相互作用图，其中a为利用酵母双杂交检测rlk902与edr4存在相互作用；b为在烟草瞬时表达体系中，通过萤火素酶互补成像实验检测rlk902与edr4在植物中的相互作用；c为通过转基因技术，构建稳定表达rlk902和edr4的转基因拟南芥，通过免疫共沉淀检测在稳定表达的情况下rlk902与edr4在植物中的相互作用。

图2.为rlk902突变体增强对丁香假单胞杆菌感病性图，其中a为rlk902基因以及rlk902突变体的t-dna插入突变位置示意图；b为拟南芥野生型植株col-0，rlk902突变体，grlk902/rlk902遗传互补植株接种丁香假单胞杆菌ptodc3000后菌落计数结果，c为拟南芥野生型植株col-0，rlk902突变体，grlk902/rlk902遗传互补植株接种丁香假单胞杆菌ptodc3000hrcc^-后菌落计数结果，d为接种ptodc3000后抗病相关基因pr1的基因表达水平的检测，e为接种ptodc3000后抗病相关基因pr2的基因表达水平的检测。

图3.为拟南芥中过表达rlk902增强对丁香假单胞杆菌抗性图，其中a为未接菌植物的生长表型，在短光照生长四周后进行拍照，标尺=1cm。b为通过实时定量pcr检测过表达植株中rlk902基因表达水平。c为南芥野生型植株col-0，rlk902突变体，grlk902/rlk902遗传互补植株和过量表达rlk902的转基因植株接种丁香假单胞杆菌ptodc3000后菌落计数结果，d为接种ptodc3000后抗病相关基因pr1的基因表达水平的检测，e为接种ptodc3000后抗病相关基因pr2的基因表达水平的检测。

具体实施方式

实施例一通过蛋白互作实验将候选蛋白rlk902确认为研究目标

（1）材料与方法

利用酵母菌株ah109的双杂交系统，以拟南芥野生型col-0的cdna作为模板，将扩增得到的edr4和rlk902全长cds序列连入pgadt7(ad)和pgbkt7(bd)载体中，将对应的酵母双杂交载体共转化酵母，并用pgadt7(ad)和pgbkt7(bd)空载体作为对照，双转化后酵母在缺陷syntheticdropout(sd)培养基sd-trp/-leu（检测质粒双转阳性转化酵母）和sd-trp/-leu/-his/-ade（检测同一质粒双转阳性转化酵母中两个蛋白互作情况）上进行生长，5天后进行拍照。

将edr4和rlk902的全长cds序列连入pcambia1300-nluc和pcambia1300-cluc构建萤火素酶互补成像实验所需的植物表达载体并转化农杆菌gv3101，本氏烟草在22℃、9小时光照的温室中，生长4周。将携带有相应载体的农杆菌瞬时注射转化烟草，弱光培养24小时后正常光照培养48小时，然后进行化学发光拍照。

将带有自身启动子序列的edr4和rlk902全长基因组dna序列分别构建至pmdc107和pearleygate301载体中，得到自身启动子驱动的rlk902-gfp和edr4-ha表达载体，转化拟南芥并通过筛选得到稳定的纯合转基因株系，将转基因拟南芥在在22℃、9小时光照的温室中，生长4周，提取植物总蛋白进行免疫共沉淀实验，检测蛋白相互作用。

（2）结果与分析

从酵母双杂交的结果来看，rlk902和edr4在酵母中共同表达可以使酵母在四缺培养基上生长，而单独表达并不会发生自激活，说明rlk902与edr4存在相互作用（图1a）。

通过萤火素酶互补成像实验和免疫共沉淀实验，都可以检测到rlk902和edr4的互作信号，说明在烟草瞬时表达和拟南芥稳定表达的条件下，rlk902和edr4存在相互作用，充分说明了两个蛋白的结合在植物中是存在的（图1b-c）。

实施例二rlk902突变体接种丁香假单胞杆菌ptodc3000的表型分析

（1）材料与方法

将拟南芥野生型植株col-0，rlk902突变体（arabidopsisbiologicalresourcecenter订购的t-dna插入突变,附图2a），grlk902/rlk902（上述rlk902自身启动子驱动rlk902基因组dna序列的pmdc107表达载体转化rlk902突变体得到的稳定的遗传互补拟南芥植株）和npr1突变体（已报道的感病性增强突变体，用作感病对照）种植在22℃、9小时光照的温室中，生长4周，在本研究中用作感病对照。将丁香假单胞菌（ptodc3000和ptodc3000hrcc^-）在含有利福平（rif）抗性的kb固体培养基上划线培养12h，用10mm的mgcl2收集在培养基上生长的细菌，通过梯度稀释至浓度为od600=5×10^-4。将细菌注射到4周大小的拟南芥叶片背面，在注射3h后取样，作为0天的对照（0dpi）。用打孔器取叶片。加入1ml的10mmmgcl2，充分研磨叶片，所得的叶片匀浆液稀释至10^-1和10^-2两个浓度，涂于kb平板，28℃培养2-3天后，对培养基上的菌落计数。对侵染3天后的叶片再一次用打孔器取样，加入1ml的10mmmgcl2，充分研磨叶片，所得的叶片匀浆液稀释至10^-4和10^-5两个浓度，涂于kb平板，28℃培养3天后（3dpi），对培养基上的菌落计数。

用上述接菌的方法接种ptodc3000，在0天和3天分别取叶片，提取总rna，反转录获得cdna，通过实时定量pcr检测抗病相关基因pr1和pr2的基因表达水平的变化。

（2）结果与分析

接种ptodc3000三天后，rlk902突变体的病原菌生长数量显著高于野生型，遗传互补株系grlk902/rlk902的病原菌生长数量可以恢复到与野生型类似的水平（图2b）。同样地，接种三型分泌系统缺陷型菌株ptodc3000hrcc^-，rlk902突变体也表现出增强的感病性，遗传互补植株grlk902/rlk902可以将病原菌生长数量恢复到野生型水平（图2c）。

病原菌诱导的pr基因表达量变化的检测结果表明，在接种丁香假单胞杆菌ptodc3000三天后，rlk902突变体中pr1和pr2的转录水平会明显低于野生型，遗传互补株grlk902/rlk902的pr基因表达量与野生型类似（图2d-e）。上述表型说明rlk902正向调控了植物对丁香假单胞杆菌的抗性。

实施例三过量表达rlk902的转基因拟南芥接种丁香假单胞杆菌ptodc3000的表性分析

（1）材料与方法

将上述rlk902全长cds序列连入pearleygate102载体中，得到35s启动子驱动的rlk902过表达载体，转化拟南芥，通过除草剂basta筛选得到纯合转基因株系，通过实时定量pcr检测，获得显著提高rlk902基因表达水平的转基因株系。

将野生型col-0，rlk902突变体，grlk902/rlk902遗传互补植株以及rlk902过表达植株种植在22℃、9小时光照的温室中，生长4周。将丁香假单胞菌（ptodc3000）在含有利福平（rif）抗性的kb固体培养基上划线培养12小时，用10mm的mgcl2收集在培养基上生长的细菌，通过梯度稀释至浓度为od600=5×10^-4。将细菌注射到4周大小的拟南芥叶片背面，3天后用打孔器取样，加入1000μl的10mmmgcl2，充分研磨叶片，所得的叶片匀浆液稀释至10^-4和10^-5两个浓度，涂于kb平板，28℃培养3天后（3dpi），对培养基上的菌落计数。

取未接菌处理的拟南芥叶片，提取总rna，反转录获得cdna，通过实时定量pcr检测抗病相关基因pr1和pr2在不同的遗传背景下的基因表达水平。

（2）结果与分析

在正常条件生长下，过表达株系的植株表现出了生长矮小且伴随自发细胞死亡的生长表型（图3a），通过定量pcr检测，我们得到的这两个过量表达rlk902的转基因植株oe-1和oe-2，rlk902的基因表达水平显著高于野生型植物（图3b）。接种ptodc3000后，过表达株系的菌落生长数量显著低于野生型，说明过量表达rlk902可以增强植物对丁香假单胞杆菌的抗性（图3c）。

同时我们通过实时定量pcr检测到在未接菌的情况下，rlk902过表达植物中pr1和pr2的基因表达水平也显著高于野生型（图3d-e），组成性提高抗病相关基因的表达水平可能是过表达rlk902提高植物抗病性的原因之一。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>植物抗病相关基因rlk902及其应用

<130>2

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<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1944

<212>dna

<213>人工序列

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