本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及一种组蛋白甲基化h3k4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
背景技术：
生产繁殖效率对猪肉的经济效益有很大影响，约10％～30％的选育后备母猪因乏情或受孕易失败被淘汰，近年来国内外学者在生产繁殖性状的基础研究和实际应用方面开展了许多工作。就雌性动物来说卵巢是母猪正常繁殖的基础，卵泡的生长分化是卵巢机能的重要保证，颗粒细胞的分化和生长是原始卵泡生长启动的关键，猪卵巢颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要标志，当卵泡发生闭锁时，颗粒细胞产生的雌激素减少，孕激素随之增加，从而引起机体一系列生理生化反应。影响母猪生产繁殖效率的因素主要包括：遗传、饲喂量和营养、温度、光照及其他因素，其中表观遗传学是近年来的研究热点。
表观遗传学(epigenetics)是指在dna双链序列未改变的情况下，基因的表达发生改变，即未改变基因型的前提下改变表型。表观遗传的现象有很多，已知的有dna甲基化(dnamethylation)、组蛋白修饰(histonemodification)、基因组印记(genomicimprinting)、母体效应(maternaleffects)、基因沉默(genesilencing)、rna编辑(rnaediting)等。其中组蛋白翻译后修饰发生在核小体八聚体的各个组份上，例如h3组蛋白上4号赖氨酸的3甲基化(tri-methylationofhistoneh3lysine4，h3k4me3)，一个特定的组蛋白赖氨酸甲基转移酶(hmt)将3个甲基团转移到h3上，在表观遗传研究中h3k4me3是一个具有转录活性的典型染色质标记，santos-rosa等研究表明，h3的4号赖氨酸甲基化可以募集核小体重塑酶和组蛋白乙酰化酶，从而正向调节基因的转录。
组蛋白甲基化在不同功能元件具有不同的作用功能，在启动子区h3k4me3负责转录激活，bradley等的研究表明h3k4me3和h3k27me3在胚胎干细胞(embryonicstemcell，escs)基因组中以共价域(bivalentdomains，bds)形式调控与发育相关的转录因子(transcriptionalstartsite，tfs)，h3k4me3区域直接与tfs基因的转录起始位点(transcriptionalstartsite，tsss)重合，且bds在不同的生理进程中会伴随不同基因表达的激活或抑制。此外h3k4me3结合在基因上的宽度与在细胞识别种类相关，h3k4me3分布情况与基因的转录水平相关。而目前组蛋白甲基化或去甲基化修饰对猪卵巢颗粒细胞的影响仍未见报道。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种组蛋白甲基化h3k4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
选择h3k4me3抑制剂bcl-121(sigma，货号sml1817)和h3k4me3激动剂pbit(sigma，货号sml1058)，通过对细胞形态检测及westernblot实验方法寻找药物处理猪卵巢颗粒细胞的最佳作用浓度。使用合适的浓度药物处理细胞后，采用westernblot实验方法探究对应浓度药物对h3k4me3蛋白含量的影响；采用edu和cck-8实验方法探究h3k4me3对猪卵巢颗粒增殖的影响；采用annexinv/pi和caspase-3/7实验方法探究h3k4me3对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响；采用流式检测实验方法探究h3k4me3对猪卵巢颗粒细胞周期的影响；采用elisa方法探究h3k4me3对猪卵巢细胞e2分泌量的影响。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种组蛋白甲基化h3k4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
体外环境下，h3k4me3能够促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡，降低阻滞于go/g1期的猪卵巢颗粒细胞比例。
优选的，抑制h3k4me3的抑制剂bcl-121的使用浓度为125～150μm；更优选的，最适使用浓度为150μm。
优选的，促进卵巢颗粒细胞的增殖或抑制卵巢颗粒细胞的凋亡所用的h3k4me3激动剂pbit的使用浓度为2～4μm；最适使用浓度为2μm。
本发明还提供一种组蛋白甲基化h3k4me3在促进猪卵巢颗粒细胞中e2生成的应用。
优选的，抑制h3k4me3的抑制剂bcl-121的使用浓度为125～150μm；更优选的，最适使用浓度为150μm。
优选的，促进猪卵巢颗粒细胞中e2生成所用的h3k4me3激动剂pbit的使用浓度为2～4μm；最适使用浓度为2μm。
本发明的验证结果如下：
1、选择最适处理猪卵巢颗粒细胞的药物浓度
分别使用50μm、75μm及100μm浓度的h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)药物处理细胞，在显微镜下观察细胞状态。
进一步根据细胞状态使用100μm、125μm及150μm浓度的h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处粒细胞，观察细胞状态，选择细胞状态较好的125μm和150μm使用浓度，药物处理后的细胞，使用westernblot方法检测并对细胞中h3k4me3的含量。
进一步根据细胞状态使用2μm、4μm6μm、8μm及10μm浓度的h3k4me3激动剂(pbit)药物处粒细胞，观察细胞状态，选择细胞状态较好的2μm和4μm使用浓度，药物处理后的细胞，使用westernblot方法检测并对细胞中h3k4me3的含量。
最终确定h3k4me3的抑制剂bcl-121的最适使用浓度为150μm；h3k4me3激动剂pbit的最适使用浓度为2μm。
2、药物对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响
设置浓度梯度后，确认h3k4me3抑制剂(bcl-121)的最适使用浓度为150μm，h3k4me3激动剂(pbit)的最适使用浓度为2μm。
为研究h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响，分别药物处理细胞，利用cck-8及edu法来分析细胞增殖情况。
cck-8结果(图1a)证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞可以显著抑制细胞增殖；h3k4me3激动剂(pbit)可以显著促进细胞增殖。
edu结果(图1b～1d)证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞能够显著抑制细胞增殖；h3k4me3激动剂(pbit)可以持续且显著促进细胞增殖。
3、药物对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响
为研究h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响，分别药物处理细胞，利用caspase-3/7及annexinv-fitc法来分析细胞凋亡情况。
caspase-3/7结果(图2a)证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞24h内显著促进细胞凋亡；h3k4me3激动剂(pbit)处理细胞24h内能够显著抑制细胞凋亡。
annexinv-fitc结果(图2b～2d)证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞24h内显著促进细胞凋亡；h3k4me3激动剂(pbit)处理细胞24h能够抑制细胞凋亡，而超过24h后药物作用效果逐渐减弱。
4、药物对猪卵巢颗粒细胞周期的影响
为研究h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)对猪卵巢颗粒细胞周期的影响，分别药物处理细胞，利用流式检测法来分析细胞周期的变化情况。
流式检测法检测细胞周期的各个时间段(图3)，结果证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞24h内，阻滞于go/g1期的细胞比例显著升高，从而减缓了细胞的增殖(图3a)；h3k4me3激动剂(pbit)处理细胞24h内，阻滞于go/g1期的细胞比例显著降低，从而加速了细胞的增殖(图3b)，而超过24h后药物作用效果逐渐减弱。
5、药物对猪卵巢颗粒细胞e2分泌量的影响
使用h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)分别处理对猪卵巢颗粒细胞，收集细胞上清，利用elisa检测细胞上清中e2的含量(图4)。elisa检测检测结果表明h3k4me3能够促进猪卵巢颗粒细胞分泌e2。
本发明以h3组蛋白上4号赖氨酸的3甲基化(tri-methylationofhistoneh3lysine4，h3k4me3)为切入点，采用细胞生物学方法研究其对猪卵巢颗粒细胞功能的影响。关键点和欲保护点：(1)h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)处理细胞的最适使用浓度；(2)h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)在猪卵巢颗粒细胞凋亡、增殖及周期中的应用；(3)h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)处理细胞后，猪卵巢颗粒细胞中雌二醇(e2)分泌量的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明技术方案设计周详，结果可靠。为证实h3k4me3对猪卵巢颗粒细胞功能的影响，本发明从多层次、多角度验证，在细胞水平以及蛋白水平进行验证。本发明阐明了h3k4me3对猪卵巢颗粒细胞功能的影响，这些对研究组蛋白甲基化对卵巢卵泡发育及母猪繁殖性能的影响机制具有很好的应用价值。
附图说明
图1是cck-8及edu法来分析猪卵巢颗粒细胞的增殖情况；其中，a是cck-8法检测h3k4me3对猪颗粒细胞增殖的影响；b是edu法检测药物处理后h3k4me3对猪颗粒细胞增殖的影响；c是edu法检测药物处理24h后荧光图(左图：edu，右图：hoechst)；d是edu法检测药物处理48h后荧光图(左图：edu，右图：hoechst)。
图2是caspase-3/7及annexinv-fitc法来分析猪卵巢颗粒细胞的凋亡情况；其中，a是caspase-3/7法检测h3k4me3对颗粒细胞凋亡的影响；b是annexinv-fitc法检测药物处理后h3k4me3对颗粒细胞凋亡的影响；c是annexinv-fitc法检测药物处理24h后流式图；d是annexinv-fitc法检测药物处理48h后流式图。
图3是流式检测法分析药物对猪卵巢颗粒细胞周期的影响情况；其中，a是流式检测法检测h3k4me3抑制剂(bcl-121)对颗粒细胞周期的影响；b是流式检测法检测h3k4me3激动剂(pbit)对颗粒细胞周期的影响。
图4是h3k4me3药物对猪卵巢颗粒细胞e2分泌量的影响。
注：bcl-121表示用150μm的dmso溶液配制的含有150μmbcl-121的溶液；dmso-150表示150μm的dmso溶液，作为bcl-121的对照；pbit表示用2μm的dmso溶液配制的含有2μmpbit的溶液；dmso-2表示2μm的dmso溶液，作为pbit的对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1猪卵巢颗粒细胞的培养
(1)本发明猪卵巢颗粒细胞的采集自嘉禾望岗屠宰场，采集屠宰母猪卵巢保存于含1％双抗(青霉素和链霉素)的pbs试剂中，低温迅速带回实验室处理；
(2)用含1％双抗的pbs清洗卵巢数次，转移样品至细胞房；
(3)提前将超净台紫外照射细胞房超净台20min，并用用75％的酒精擦拭；
(4)镊子夹取卵巢，用1ml注射器吸取卵泡液于5mldmem培养基，每管吸取卵泡液至9ml；
(5)800rpm离心5min，弃上清，加入预热的pbs轻柔吹打沉淀细胞，清洗两次。
(6)在75ml细胞培养瓶中培养，先在培养瓶中加入10ml完全培养基(含10％小牛血清和1％双抗)，再加入5ml细胞细胞悬液，轻柔地摇晃均匀；
(7)置于37℃，5％co2培养箱，48h后观察猪卵巢颗粒细胞生长状况；
(8)用含预热的含1％双抗的pbs清洗两次，再培养24h后可进行后续实验。
实施例2摸索h3k4me3激动剂和抑制剂的药物使用浓度
(1)用胰酶消化培养的细胞，放入37℃，5％co2培养箱3～5min，显微镜下观察到大部分细胞悬浮，立即加入等量完全培养基终止消化；
(2)收集细胞悬液800rpm离心5min，用预热的pbs清洗细胞两遍，用完全培养基重悬，将细胞悬液均匀加入6孔板中，轻柔地摇晃均匀，放入37℃，5％co2培养箱培养24h。
(3)观察细胞状态，当细胞汇合度达到80％左右时，使用h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)药物处理细胞，进行后续实验。
(4)分别使用50μm、75μm及100μm浓度的h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)药物处理细胞，在显微镜下观察细胞状态。
(5)进一步根据细胞状态使用100μm、125μm及150μm浓度的h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处粒细胞，观察细胞状态，选择细胞状态较好的125μm和150μm使用浓度，药物处理后的细胞，使用westernblot方法检测并对细胞中h3k4me3的含量。
(6)进一步根据细胞状态使用2μm、4μm、6μm、8μm及10μm浓度的h3k4me3激动剂(pbit)药物处粒细胞，观察细胞状态，选择细胞状态较好的2μm和4μm使用浓度，药物处理后的细胞，使用westernblot方法检测并对细胞中h3k4me3的含量。
实施例3westernblot
(1)细胞总蛋白抽提(使用北京普利莱基因技术有限公司的p1250总蛋白抽提试剂盒)：
①消化并清洗细胞，800rpm离心收集细胞，每5～10*106细胞加入0.5ml裂解液，振荡重悬，4℃净值2min；
②按比例每0.5ml裂解液加入1ml抽提试剂，振荡混匀，4℃静置10min；
③10,000rpm4℃离心10min，溶液分为上下两相，吸取上层相，尽可能吸取下层相，收集两相溶液中间的蛋白絮状物，如果不能分相，则再次用50μl蒸馏水混匀后离心；
④加入1ml乙醇洗涤沉淀，10,000rpm4℃离心3min，去除管内所有液体，室温干燥。
(2)sds-page：
①使用多功能酶标仪波长测定a562，计算各浓度蛋白标准的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程，蛋白定量(使用bca蛋白定量试剂盒)；
②样品制备，混合20μg总蛋白与5×上样缓冲液按5:1，煮沸5min；
③制胶点样，跑浓缩胶的电压在60～100v，约30分钟，跑分离胶的电压在100～200v，约60分钟(当溴芬蓝跑至离胶底端1～2cm左右，停止电泳；或根据具体情况调整跑胶电压与时间)；
④根据蛋白marker的分子量标准切下含有目的蛋白的胶条，选择转膜电流300ma，20min；
⑤转膜结束后，用tbst轻轻冲洗膜，用5％的脱脂奶粉室温封闭1～2h；
⑥用tbst轻轻冲洗膜6次，每次5min，用tbst1:5000稀释一抗histoneh3trimethylk4(购自abcam)，4℃孵育过夜；
⑦用tbst轻轻冲洗膜6次，每次5min，1:4000稀释二抗goatanti-rabbitigg-hrp(购自santacruz)，室温孵育2小时左右；
⑧用tbst轻轻冲洗膜6次，每次5min，用ecl显色试剂盒显色；
⑨在暗房中观察荧光的明亮度确定曝光的时间，洗片进行显影和定影，拍照(或扫描)，采用imageplus软件分析胶片中的蛋白条带。
实施例4颗粒细胞增殖检测
本发明使用cck-8法检测细胞增殖，参照上海同仁公司cck-8细胞增殖-毒性检测试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
(1)制作标准曲线：
①先用细胞计数板计算细胞悬液中细胞的数量，接种细胞；
②按比例设置5个细胞浓度梯度，每个梯度3～6个重复；
③接种后培养5h，每孔加入100μlcck-8溶液，孵育2h，用酶标仪a450测定od值；
④绘制标准曲线(细胞数量为x轴，od值为y轴)。
(2)细胞活性检测：
①取细胞接种于96孔板，培养细胞至融合度为50～80％；
②每孔加入100μlcck-8溶液，在细胞培养箱中孵育2h；
③用酶标仪a450测定od值。
本发明使用edu法检测细胞增殖，参照锐博公司cell-lighttmeduapollo567invitrokit检测试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
(1)取细胞接种于48孔板，培养细胞至融合度为50～80％；
(2)制备50μmedu培养基，即为用细胞培养基稀释按照1000:1稀释edu溶液，每孔加入200μl50μmedu培养基孵育2h，pbs清洗细胞，每次3～5min；
(3)细胞固定化：向每孔加入200μl细胞固定液(用pbs稀释至80％的丙酮)，室温孵育15～30min，pbs清洗细胞，每次3～5min；
(4)细胞透化：每孔加入200μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)透化细胞，透化孵育10min，pbs清洗细胞；
(5)edu检测：每孔加入200μl的
(6)细胞再次透化：每孔加入200μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)透化细胞，透化孵育10min，pbs清洗细胞；
(7)dna染色：每孔加入200μldapi反应液，避光室温孵育30min；
(8)荧光显微镜镜检(每组三个重复)。
实施例5颗粒细胞凋亡检测
本发明使用caspase-3/7技术检测细胞凋亡，参照invitrogen公司celleventtmcaspase-3/7greendetectionreagent操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)取细胞接种于96孔板，培养细胞至融合度为50～80％，用pbs溶液清洗细胞；
(2)配置反应液，即稀释药物于完全培养基至终浓度为8％；
(3)每孔加入100μl反应液，在细胞培养箱中孵育3～5h；
(4)用酶标仪a502/530分别测定od值。
本发明使用annexinv-fitc技术检测细胞凋亡，参照参照biovision公司annexinv-fitcapoptosisdetectionkit试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
(1)取细胞接种于6孔板，培养细胞至融合度为50～80％，用pbs溶液清洗细胞；
(2)使用不含edta的胰酶消化细胞，用2mlpbs溶液清洗细胞；
(3)取0.5ml细胞悬液(约5×105个细胞)，加入500μl1×bindingbuffer；
(4)加入5μlannexinv-fitc及室温5μlpropidiumiodide，室温避光孵育5min；
(5)立即用流式细胞仪检测分析(每组3个重复)。
实施例6流式检测法检测细胞周期
本发明使用流式检测法检测细胞周期，具体操作步骤如下：
(1)取细胞接种于6孔板，培养细胞至融合度为50～80％，用pbs溶液清洗细胞；
(2)使用不含edta的胰酶消化细胞，用2mlpbs溶液清洗细胞；
(3)使用70％的乙醇溶液固定细胞，4℃固定细胞4h以上；
(4)将固定好的细胞用预冷pbs洗两次，2000rpm离心5min
(5)使用400μl溴化乙锭轻柔重悬细胞，加入100μlrnase，4℃避光孵育30min；
(6)24h内用流式细胞仪检测分析(每组3个重复)。
实施例7elisa检测细胞上清中e2的含量
本发明使用elisa技术检测细胞上清中e2的含量，参照上海江莱生物科技有限公司猪雌二醇(e2)酶联免疫吸附测定试剂盒操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl于96孔板中；
(2)取细胞接种于6孔板，培养细胞至融合度为50～80％，吸取细胞上清1000g离心20min，取50μl于96孔板即为样本孔，空白孔不加；
(3)用封板膜封住反应孔，37℃孵育30min，弃去液体，在吸水纸上拍干；
(4)每孔加入350μl洗涤液，静置1min，弃去液体，在吸水纸上拍干，重复洗板5次；
(5)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃孵育30min，弃去液体，在吸水纸上拍干；
(6)每孔加入350μl洗涤液，静置1min，弃去液体，在吸水纸上拍干，重复洗板5次；
(7)每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min；
(8)每孔加入终止液50μl，15min内用酶标仪a450测定od值。
结果分析：
1、药物对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响
设置浓度梯度后，确认h3k4me3抑制剂(bcl-121)的最适使用浓度为150μm，h3k4me3激动剂(pbit)的最适使用浓度为2μm。药物使用浓度过高会导致细胞贴壁不牢固，细胞形态发生变化，甚至死亡。
为研究h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响，分别药物处理细胞，利用cck-8及edu法来分析细胞增殖情况。
cck-8结果(图1a)证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞可以显著抑制细胞增殖；h3k4me3激动剂(pbit)可以显著促进细胞增殖。edu结果(图1b～1d)证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞能够显著抑制细胞增殖；h3k4me3激动剂(pbit)可以持续且显著促进细胞增殖。
2、药物对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响
为研究h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响，分别药物处理细胞，利用caspase-3/7及annexinv-fitc法来分析细胞凋亡情况。
caspase-3/7结果(图2a)证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞24h内显著促进细胞凋亡；h3k4me3激动剂(pbit)处理细胞24h内能够显著抑制细胞凋亡。
annexinv-fitc结果(图2b～2d)证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞24h内显著促进细胞凋亡；h3k4me3激动剂(pbit)处理细胞24h能够抑制细胞凋亡，而超过24h后药物作用效果逐渐减弱。
3、药物对猪卵巢颗粒细胞周期的影响
使用h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)分别处理对猪卵巢颗粒细胞，流式检测法检测细胞周期的各个时间段结果证实h3k4me3抑制剂(bcl-121)药物处理细胞24h内，阻滞于go/g1期的细胞比例显著升高，从而减缓了细胞的增殖(图3a)；h3k4me3激动剂(pbit)处理细胞24h内，阻滞于go/g1期的细胞比例显著降低，从而加速了细胞的增殖(图3b)。
4、药物对猪卵巢颗粒细胞e2分泌量的影响
使用h3k4me3抑制剂(bcl-121)及h3k4me3激动剂(pbit)分别处理对猪卵巢颗粒细胞，收集细胞上清，利用elisa检测细胞上清中e2的含量(图4)。elisa检测检测结果表明h3k4me3能够促进猪卵巢颗粒细胞分泌e2。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。