蝴蝶兰PP2A基因作为内参基因的应用的制作方法

本发明属于蝴蝶兰基因工程技术领域，具体涉及一个蝴蝶兰pp2a基因作为内参基因应用专利申请事宜。

背景技术：

蛋白磷酸酶2a（proteinphosphatase2a，pp2a）是真核生物体内一种主要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，由结构亚基a、催化亚基c和调节亚基b组成，在植物中主要控制信号转导和细胞代谢。在动物和酵母中，pp2a在多条信号途径中发挥作用。然而，其在植物信号途径中的作用知之甚少，目前发现其主要参与脱落酸、植物生产素和乙烯等激素的信号转导。

蝴蝶兰（phalaenopsisspp.）为兰科蝴蝶兰属单茎性附生兰的统称，因其花型优美，花色丰富多彩，花期较长，具有很高的观赏价值而成为多年来年宵花中的畅品。原产热带亚热带地区，性喜暖畏寒，生长适温为18～28℃，冬季10℃以下就会停止生长。因此，低温是影响蝴蝶兰生长的重要环境因子。而我国北方地区冬春季温度较低，如需培育蝴蝶兰，则需在现代化温室内培养，而加温成本较高，耗能巨大，因而导致生产成本大幅攀升，制约了蝴蝶兰产业的健康发展。也因此，耐冷性资源和基因挖掘是蝴蝶兰育种工作的重要目标之一。

在蝴蝶兰耐冷性基因筛选过程中，实时荧光定量pcr是较为常用的技术手段之一。而实时荧光定量pcr技术的应用基础之一是合适内参基因的选择。现有技术中，针对蝴蝶兰已报道过较多内参基因。但众所周知的是：内参基因原则上是在某个条件下恒定表达的基因，从而为检测目的基因在特定条件下的表达水平情况作为参考；但实际工作中，在任何条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在。也因此，需对不同情况筛选最适的内参基因。而就蝴蝶兰耐冷性基因筛选而言，尚未见到较好的可以作为耐冷性基因筛选中内参基因的有关报道。

技术实现要素：

本发明主要目的在于提供一个蝴蝶兰pp2a基因，研究表明，该基因在正常生长温度和低温胁迫条件下在不同蝴蝶兰品种以及不同时间均能稳定表达，因此具有作为内参基因应用潜力，而基于该内参基因，可为蝴蝶兰相关功能基因研究及耐低温蝴蝶兰资源的筛选奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

蝴蝶兰pp2a基因，该基因在正常生长温度和低温胁迫条件下表达均较为稳定一致，所述pp2a基因，其cdna序列长度为2207bp，包含一个完整的、长1764bp的orf，具体cdna碱基序列如seqidno.1所示。

针对该基因，利用pcr进行扩增时，引物序列可参考设计如下：

pp2a-f：5’-tttgagygatttgtgaaggc-3’，

pp2a-r：5’-tggaaaaamataacagcagg-3’。

所述蝴蝶兰pp2a基因所编码磷酸蛋白酶2a（pp2a），该蛋白包括587个氨基酸，氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述蝴蝶兰pp2a基因作为内参基因的应用，用于分析评价相关功能基因表达情况，具体例如用于功能基因nac域蛋白基因（phnac1）的表达分析。

以蝴蝶兰pp2a基因作为内参基因的实时荧光定量pcr检测分析方法，检测分析时，针对蝴蝶兰pp2a基因，引物序列设计如下：

qpp2a-f：5'-tctgttggctgtggaaggat-3'，

qpp2a-r：5'-aaatccgacctggtagtttctg-3'。

所述蝴蝶兰pp2a基因作为内参基因的实时荧光定量pcr检测分析方法，在检测分析phnac1表达情况时，针对nac域蛋白基因（phnac1），引物序列设计如下：

qphnac1-f：5'-atctgaacaagtgcgagcct-3'，

qphnac1-r：5'-atccttaccagttgccttcc-3'。

本申请首次在蝴蝶兰低温胁迫转录组数据库中挖掘到pp2a基因cdna，对基因的分析表明，该cdna序列包含一个完整的、长1764bp的orf，编码磷酸蛋白酶2a（pp2a）。进一步利用实时荧光定量pcr技术对该pp2a基因在蝴蝶兰正常生长温度及低温胁迫条件下的表达情况研究表明，该基因表达量较为稳定，具有作为内参基因应用潜力。进一步将其作为内参基因用于分析phnac1基因表达情况时，表现出较为准确的分析结果。

总体上，本申请所提供的pp2a基因，其在低温胁迫情况下表达较为稳定，利用这一特性，可为蝴蝶兰耐冷性基因筛选及耐冷性蝴蝶兰种质资源筛选奠定良好的分析应用基础，因此具有较好的实用价值和科研应用意义。

附图说明

图1为蝴蝶兰pp2a基因实时荧光定量pcr的熔解曲线；

图2为蝴蝶兰pp2a基因实时荧光定量pcr的标准曲线；

图3为pp2a基因在不同品种蝴蝶兰低温胁迫不同时间实时荧光定量pcr的荧光阈值；

（图注：d：蝴蝶兰品种“大辣椒”；f：蝴蝶兰品种“富乐夕阳”；ck1：正常生长温度；ck2：16℃/11℃处理3d后；t1：11℃/6℃处理1天后；t2：11℃/6℃处理2天后；t3：11℃/6℃处理3天后；t5：11℃/6℃处理5天后；t7：11℃/6℃处理7天后；0h：蝴蝶兰品种“大辣椒”正常生长温度；1h、2h、4h、12h、24h、48h：蝴蝶兰品种“大辣椒”4℃处理1h、2h、4h、12h、24h、48h）；

图4为pp2a在不同品种蝴蝶兰低温胁迫不同时间的表达电泳图；

图5为pp2a作为内参基因在蝴蝶兰phnac1基因定量表达研究中的应用；

图6为actin作为内参基因在蝴蝶兰phnac1基因定量表达研究中的应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

蝴蝶兰“大辣椒”（phalaenenopsisbigchili）和“富乐夕阳”（phalaenenopsisfuller’ssunset），两种均为常见蝴蝶兰栽培品种；下述实施例中所采用材料取自郑州师范学院兰花工程技术中心智能日光温室内；

相关引物序列合成及测序工作由上海英俊生物技术公司提供完成；

实验试剂：

reversetranscriptasem-mlv试剂（用于pcr的反转录制备cdna）、primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser（用于实时荧光定量pcr的反转录制备cdna）、sybr®premixextaqtm（用于实时荧光定量pcr）等，购自takara公司；

rnaprep多糖多酚植物总rna提取试剂盒等，购自天根试剂公司；

实验仪器：

微量分光光度计（rna浓度测定用），美国quawellq5000；

荧光定量pcr仪mastercyclereprealplex2，德国eppendorf公司产品；

植物人工气候箱，美国percivale-41ho2。

实施例1

本实施例主要对蝴蝶兰内参基因pp2a的获得过程及序列结构特征简要介绍说明如下。

（1）低温胁迫处理及cdna模板制备

前期实验设计中，为筛选获得低温胁迫条件下及正常生长下表达情况均较为稳定的基因，发明人对相关蝴蝶兰材料进行了低温胁迫处理，具体处理方式为：

在温室大棚内选取同生长期的两年生蝴蝶兰两个品种“大辣椒”（下文以d替代表示）和“富乐夕阳”（下文以f替代表示），于植物人工气候箱中正常温度26℃/22℃预培养15d（培养条件：光照60μmol·m^-2·s^-1，光暗比12h/12h，相对湿度70~90%），然后低温胁迫处理不同时间，每个处理3株，设三次生物学重复；

低温胁迫处理方法：采用模拟自然状态逐步降温法，即，先昼夜温度20℃/16℃处理3d，然后16℃/11℃处理3d，最后11℃/6℃处理7d；每一次温度的变化均采用每小时升高或降低1℃的方式。

以正常生长温度的叶片为对照1（ck1）取样，16℃/11℃处理3d后为对照2（ck2）取样，于11℃/6℃处理后1d（t1）、2d（t2）、3d（t3）、5d（t5）和7d（t7）取样。

另取一组蝴蝶兰品种“大辣椒”，4℃低温处理不同时间：1h、2h、4h、12h、24h、48h取样，以正常生长温度的叶片为对照（0h）取样。

对所取样品，参考试剂盒说明书，利用rnaprep多糖多酚植物总rna提取试剂盒说明书，分别提取不同蝴蝶兰样品叶片的21个总rna（dck1、dck2、dt1、dt2、dt3、dt5、dt7、fck1、fck2、ft1、ft2、ft3、ft5、ft7、0h、1h、2h、4h、12h、24h、48h），并利用琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取总rna的完整性；同时，测定总rna的a260/a280值和a260/a230值，以及测定所提取总rna的浓度。

电泳检测结果表明：28s、18s和5s条带清晰，28s条带的亮度大约是18s的2倍。测定结果表明：a260/a280均在1.8～2.1之间，总rna浓度在200～350ng/µl之间。这些结果表明，所提取总rna质量较好，均可用于后续反转录cdna制备用。

进一步地，参考说明书，利用primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒反转录成的cdna第一链，作为实时荧光定量pcr反应的模板，直接应用，或者将所制备cdna-20℃保存备用。

（2）转录组测序及pp2a基因的获得

将正常生长温度和低温处理条件下培养的两个蝴蝶兰不同处理时间的叶片进行rna-seq测序，从转录组结果数据库中得到pp2a基因的cdna序列，测序及分析结果表明：pp2a基因的cdna全长为2207bp，包含一个完整的orf，该orf长1764bp，编码蛋白磷酸酶2a（pp2a）。

需要解释的是，根据前期生理实验结果，发明人判定蝴蝶兰“大辣椒”为抗冷品种，而“富乐夕阳”为不抗冷品种，基于这种表型差异，对两个品种在低温胁迫下不同处理时间的转录组进行了测序。测序比对过程中，发现pp2a基因不受品种和处理时间的影响，即在两个品种不同时间表达量基本一致，因此推测该基因可作为内参基因使用。为了进一步确定该实验推测，发明人进行了后续的实时荧光定量pcr实验（参见实施例2），进一步证明了该推测结果。

还需说明的是，进一步blast比对分析表明，该蝴蝶兰pp2a基因序列与已登录的小兰屿蝴蝶兰pp2a（genbank登录号：xm_020743358）基因序列一致性为99%，orf区有15个碱基不同，编码的氨基酸序列与小兰屿蝴蝶兰pp2a一致性为99%，有1个氨基酸不同，但现有技术中针对小兰屿蝴蝶兰pp2a的表达特性及其具体用途是缺乏进一步研究和探讨的。

实施例2

在实施例1的基础上，本实施例主要就蝴蝶兰pp2a基因在正常生长温度及低温胁迫条件下转录表达的稳定性进行了研究分析，具体实验情况简要介绍说明如下。

（1）实时荧光定量pcr引物设计

基于实施例1的测序结果，设计pp2a基因实时荧光定量pcr引物序列如下：

qpp2a-f：5'-tctgttggctgtggaaggat-3'，

qpp2a-r：5'-aaatccgacctggtagtttctg-3'；

需要说明的是，基于该引物序列的扩增产物长度为186bp。

（2）实时荧光定量pcr反应

取等量的实施例1中所制备的蝴蝶兰不同品种、不同低温处理条件及时间的叶片的21个cdna样品，混合均匀作为标准品，分别稀释10倍、100倍、1000倍和10000倍及未稀释样品作为5个梯度，分别以5个梯度的cdna为模板，利用步骤（1）中所设计的引物进行实时荧光定量pcr反应（3次重复）；

荧光定量pcr反应时，20.0μl反应体系设计如下：

2×sybrpremixextaqⅱ，10.0μl；

引物f和r（均为10mmol/l），各0.8μl；

cdna模板，2.0μl；

ddh2o，6.4μl；

反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s，进行40个循环。

由实时荧光定量pcr仪自动生成熔解曲线和标准曲线。熔解曲线如图1所示，分析可以看出，pp2a基因实时荧光定量pcr的熔解曲线均为单峰，表明所设计的引物具有特异性，产物单一。标准曲线如图2所示，分析可知，pp2a基因实时荧光定量pcr的标准曲线为y=－3.299x+20.17，扩增效率为101%，相关系数为0.999。

以实施例1中21个蝴蝶兰不同品种不同低温处理的样品cdna为模板，进行实时荧光定量pcr反应，结果如图3所示，得到在这21个样品中ct循环阈值的平均值为21.51～23.42，表明用pp2a引物进行实时荧光定量pcr结果可靠，pp2a基因可以用于蝴蝶兰正常生长温度及低温处理条件下的实时荧光定量pcr研究。

进一步将反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图4所示，可以看出，pp2a基因在21个样品中的亮度基本一致，表明在这21个样品中表达比较稳定。

实施例3

基于实施例2的结果，可以判断蝴蝶兰pp2a基因具有作为内参基因应用的潜力。因此，发明人以蝴蝶兰pp2a基因作为内参基因，以nac域蛋白基因phnac1为例，对该基因在蝴蝶兰低温胁迫条件下两个不同品种不同处理时间叶片中的表达特性进行了研究分析，相关实验过程简要介绍如下。

（1）引物设计

实时荧光定量pcr检测nac域蛋白基因（phnac1）时，引物设计如下：

qphnac1-f：5'-atctgaacaagtgcgagcct-3'，

qphnac1-r：5'-atccttaccagttgccttcc-3'；

需要说明的是，利用该引物序列扩增时，扩增产物长度为155bp。

（2）实时荧光定量pcr检测

以实施例1中获得的21个蝴蝶兰样品cdna为模板，以phnac1基因的qphnac1-f和qphnac1-r为引物，进行实时荧光定量pcr检测（3次重复）；20.0μl反应体系设计如下：

2×sybrpremixextaqⅱ，10.0μl；

引物f和r（均为10mmol/l），各0.8μl；

cdna模板，2.0μl；

ddh2o，6.4μl；

反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s，进行40个循环。

phnac1基因相对表达量采用2^-δδct法计算。

实验结果如图5所示。分析可以看出，蝴蝶兰两个品种“大辣椒”和“富乐夕阳”在11℃/6℃低温处理条件下，phnac1基因相对表达量均在ck2中明显上升；当逐步降温过程结束进行11℃/6℃处理1d后（t1）表达量均有所下降，之后又开始逐渐升高，第5d时（t5）最高，“大辣椒”在第7d（t7）又下降而“富乐夕阳”继续升高。“大辣椒”品种在4℃低温处理条件下，4h内表达量有所下降，之后12h、24h和48h呈逐渐升高趋势。

实施例4

为进一步考察pp2a在作为蝴蝶兰内参基因应用时结果的准确性，参考实施例3的操作，本申请以常用的actin作为内参基因，对蝴蝶兰的nac域蛋白基因（phnac1）的表达情况进行了分析，相关过程简要介绍如下。

实时荧光定量pcr反应所用actin引物设计如下：

qactin-f:5'-gttctttccctatatgctagtggc-3'，

qactin-r:5'-gaaggatggcatgaggaagtg-3'。

pcr反应体系、反应条件及基因相对表达量计算方法同实施例3。

实验结果如图6所示。分析可以看出，以actin为内参基因时，phnac1基因在蝴蝶兰两个品种不同低温处理时间下的相对表达水平，与以pp2a为内参基因时phnac1基因表达量变化总体趋势基本一致（但个别生长阶段也有细微区别）。总体上，以pp2a作为内参基因进行相关功能基因分析结果是较为可靠的。

sequencelisting

<110>郑州师范学院

<120>蝴蝶兰pp2a基因作为内参基因的应用

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