芽孢杆菌HY-1及其降解有机污染物的应用的制作方法

本发明涉及一株高效新型正己烷降解菌——芽孢杆菌(bacillussp.)hy-1及其在微生物降解正己烷等有机污染物的应用。

(二)

背景技术：

正己烷是一种低毒、有微弱的特殊气味的无色液体。正己烷是一种化学溶剂，主要用于丙烯等烯烃聚合时的溶剂、食用植物油的提取剂、橡胶和涂料的溶剂以及颜料的稀释剂等，因其价格低廉，用途广泛，所以工业上使用比较普遍。

但是正己烷易挥发进入环境，危害人体健康。吸入高浓度正己烷会造成急性中毒，出现头痛、头晕、恶心等症状，重者引起神志丧失甚至死亡。对眼和上呼吸道有刺激性。吸入超过500mg/kg可引起头痛、腹泻、脸发烧、四肢麻木等。超过1300mg/kg还可引起恶心、鼻炎及咽喉炎。超过1500mg/kg还引起视力模糊、食欲减退和降低体重。长期接触可造成慢性中毒，出现头痛、头晕、食欲不振，四肢麻木，触、痛等感觉减退，损害神经系统。职业性慢性正己烷中毒是由于长期接触生产环境中正己烷气体而引起的以神经系统损伤为主的全身性疾病。

正因为正己烷的应用广泛及其毒性，因此研究环境中正己烷的高效降解对人类健康很有必要，此前已有研究者利用芽孢杆菌来处理vocs，如清华大学李国文曾利用芽孢杆菌在过滤塔中处理甲苯达到了90％的去除率，这说明利用芽孢杆菌来处理vocs是可行的。但未曾发现国内外有报道称筛选出芽孢杆菌以正己烷为唯一碳源来实现正己烷的高效降解。本发明从环境中筛选到一株以正己烷为唯一碳源的高效降解菌株，为处理含该类污染物的生物净化工程提供了有力支持。

生物净化技术具有净化效率高，运行成本低等特点。微生物环境适应性较强，能在较复杂的情况下处理多组分的有机污染物。如果能筛选得到以正己烷为唯一碳源的芽孢杆菌来实现正己烷的高效降解，既能很好的解决正己烷的生物降解问题，也能为芽孢杆菌高效处理vocs增添又一新的实例。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株新型高效正己烷降解菌——芽孢杆菌(bacillussp.)hy-1及其在微生物降解正己烷等有机污染物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株--芽孢杆菌(bacillussp.)hy-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年10月26日，保藏编号：cctccno:m2018713，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

所述芽孢杆菌hy-1的16srdna的genebank登录号为mh211143，该菌株的主要生物学特征为：菌体呈杆状，大小为(0.6～1.07)μm×(2.125～1.5)μm，产芽孢(无芽孢时长度较大，宽度较小；有芽孢时长度较小，宽度较大)，无鞭毛；菌落呈圆形、灰白色、不透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；好氧，革兰氏染色阳性。

本发明还涉及所述芽孢杆菌hy-1在微生物降解有机污染物中的应用，具体所述的应用为：将芽孢杆菌hy-1经扩大培养获得的菌液为酶源，以有机污染物为底物，于无机盐培养基中，在ph＝4～10、20℃～40℃、160rpm条件下(优选ph＝6～7、25℃～30℃)进行降解反应，实现对有机污染物的降解。所述有机污染物为正己烷、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、石油醚或乙醇，所述有机污染物在无机盐培养基中的加入浓度为20～1600mg/l(优选155～770mg/l)，所述菌液加入量以无机盐培养基中od600计为0.01～0.5，优选0.01。

进一步，所述底物为有机污染物气体，所述气体为正己烷气体或混合气体，所述正己烷气体浓度为5～1000mg/m³，所述混合气体由下列浓度的气体组成：100mg/m³正己烷、100mg/m³乙酸乙酯、100mg/m³乙酸丁酯、100mg/m³正丁醇、80mg/m³乙醇、80mg/m³石油醚。

所述无机盐培养基终浓度组成：na2hpo4·12h2o4.5g/l、kh2po41.0g/l、

(nh4)2so42.5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、无水cacl20.023g/l，微量元素母液1ml/l，ph7.0，溶剂为去离子水；所述微量元素母液终浓度组成：feso4·7h2o1.0g/l、cuso4·5h2o0.02g/l、h3bo30.014g/l、mnso4·4h2o0.10g/l、znso4·7h2o0.10g/l、na2moo4·2h2o0.02g/l、cocl2·6h2o0.02g/l，溶剂为去离子水。

本发明所述酶源按如下步骤制备：

1)斜面培养：将芽孢杆菌hy-1接种于斜面lb固体培养基，30℃培养18～26h，获得斜面菌体，所述lb固体培养基组成为：nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然；

2)扩大培养：用接种环挑取步骤1)获得的斜面菌体接种至lb液体培养基中，30℃培养24～36h，获得od600＝0.1～0.2的菌液；所述lb液体培养基组成：nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株有机污染物特别是正己烷的高效降解菌--芽孢杆菌hy-1，该菌革兰氏阳性细菌，能以正己烷等有机污染物为唯一碳源和能源生长繁殖并高效降解该底物，在初始菌量(以od600计)仅为od600＝0.01的情况下，能够完全降解高达770mg/l以内的正己烷等有机污染物。该菌株的生长温度和ph范围广，在20～35℃，ph为6.0～9.0范围均对正己烷降解较好，22小时降解率都能达到60％以上(25～30℃，ph为6.0～7.0时，22小时降解率可达96％以上)。对生物法净化正己烷的工程应用具有重要意义。此外，芽孢杆菌hy-1还能不同程度的降解正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、石油醚、乙醇。

(四)附图说明

图1为芽孢杆菌hy-1的透射电镜照片，a为无芽孢时的tem图，b为有芽孢时的tem图；

图2为系统发育树；

图3为芽孢杆菌hy-1的菌体生长、正己烷降解曲线图；

图4为不同ph值培养液对芽孢杆菌hy-1的正己烷降解(a)、生长(b)、矿化(c)的影响柱形图；

图5为不同温度对芽孢杆菌hy-1的正己烷降解(a)、生长(b)、矿化(c)的影响柱形图；

图6为芽孢杆菌hy-1对不同初始浓度正己烷的降解曲线图；

图7为芽孢杆菌hy-1在不同初始正己烷浓度下的生长曲线；

图8为模拟生物滴滤塔处理正己烷废气进出口浓度及去除率。

图9为模拟生物滴滤塔处理混合废气进出口浓度及去除率。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例中所用无机盐培养基组成为：na2hpo4·12h2o4.5g/l、kh2po41.0g/l、(nh4)2so42.5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、无水cacl20.023g/l，微量元素母液1ml/l，ph7.0，溶剂为去离子水；所述微量元素母液浓度组成：feso4·7h2o1.0g/l、cuso4·5h2o0.02g/l、h3bo30.014g/l、mnso4·4h2o0.10g/l、znso4·7h2o0.10g/l、na2moo4·2h2o0.02g/l、cocl2·6h2o0.02g/l，溶剂为去离子水。

所述lb固体培养基组成为：nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。

所述lb液体培养基组成为：nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。

所述室温是指25-30℃。

实施例1：芽孢杆菌hy-1的分离、纯化与鉴定

(1)芽孢杆菌hy-1的分离及纯化

现场采集浙江某制药厂污水处理池的活性污泥，取静置后的下层污泥与无机盐培养基按1:2(v/v)混合，接入3l混合液至5l污泥驯化罐(结构参见金小君.二噁烷降解新菌株的分离鉴定、降解特性及菌剂制备研究[d].浙江工业大学,2012.)，每天加入500mg/l底物正己烷作为唯一碳源和能源，室温下驯化培养，将近20天后，从驯化罐取5ml污泥加入装有50ml无机盐的摇瓶中，发现驯化的污泥在摇瓶中每天可稳定降解130mg/l正己烷，降解率可达80-90％(摇瓶实验条件：30℃、160r/min)，获得驯化样品。

将摇瓶中的污泥样品分别取1、2ml转接入其他摇瓶进一步测试性能，发现转接后的污泥在摇瓶中每天可稳定降解132mg/l正己烷，将此污泥样继续转接富集6代(每次转接1ml)，然后将富集6代后的污泥按10^-1～10^-6倍数进行lb固体培养基平板涂布，挑取单菌落，再以终浓度132mg/l正己烷为底物，进行降解活性测定，分离纯化，获得一株具有正己烷降解活性的菌株hy-1。

(2)菌株hy-1的鉴定

菌株hy-1的形态特征：菌体呈杆状，大小为(0.6～1.07)μm×(2.125～1.5)μm，产芽孢(无芽孢时长度较大，宽度较小；有芽孢时长度较小，宽度较大)，无鞭毛；菌落呈圆形、灰白色、不透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。

菌株hy-1的生理生化特征为：好氧，革兰氏染色为阳性。

pcr扩增及测序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。菌株的16srdna序列(seqidno.1)如下(genebank登录号为mh211143)：

accaccgacttgctggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggttttatgggattggcttgacctcgcggtcttgcagccctttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaacgctctatctctagagttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgctttaatgcgttagctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacaggccaaaaagccgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccgcttttctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtacgagcagttactctcgtacttgttcttccctaacaacagagttttacgacccgaaagccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctatgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcaccgcgggcccatctgtaagtgatagccgaaaccatctttcaatcatctcccatgaaggagaagatcctatccggtattagcttcggtttcccgaagttatcccagtcttacaggcaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctaacgtcatagaagcaagcttctaatcagttcg。

通过将菌株hy-1的16srdna序列上传到ezbiocloud.net网站，与网站上的标准菌株进行比对，并用mega5.05软件，采用neighbor-joining法构建细菌发育进化树，并用bootstrap法(重复1000次)进行评估，构建的系统发育树如图2，从而确定该菌株hy-1为bacillus，命名为芽孢杆菌(bacillussp.)hy-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年10月26日，保藏编号cctccno：m2018713，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

实施例2：芽孢杆菌hy-1的种子液制备

1)斜面培养：将芽孢杆菌hy-1接种于斜面lb固体培养基，30℃培养18～26h，获得斜面菌体。

2)种子培养：用接种环挑取步骤1)获得的斜面菌体接种至lb液体培养基中，30℃培养24～36h，获得od600＝0.1～0.2的菌液。

实施例3：芽孢杆菌hy-1降解正己烷的性能

以正己烷作为芽孢杆菌hy-1的唯一碳源，取实施例2方法制备的od600＝0.1菌液，接种至新鲜的含终浓度155mg/l正己烷的50ml无机盐培养基，使初始菌体浓度以od600计为0.01，ph＝7。放入温度为30℃、转数为160r/min的摇床中培养，每隔5小时取样测定正己烷降解率，并用5ml注射器抽出一部分菌液，测定菌体od值，结果见图3。实验过程中，设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。随着时间的延长，菌体浓度逐渐增大，至24h时，菌体浓度达到最大约为0.125(以od600计)，正己烷降解率达到98％以上。本实施例说明芽孢杆菌hy-1可利用正己烷作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有稳定高效降解正己烷的能力。

实施例4：无机盐培养基初始ph值对芽孢杆菌hy-1降解正己烷的影响

用1mol/lnaoh水溶液或1mol/lh2so4水溶液调节无机盐培养基为不同ph值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，在初始正己烷浓度为150mg/l的条件下接入实施例2方法制备的菌液，使各平行样中的初始菌体浓度以od600计为0.01。将样品于30℃、160r/min恒温摇床里振荡培养，培养22h后取样，测反应液中正己烷降解率、菌液od值(以od600计)和co2值，实验过程中，设计2-3个平行样和一个不接菌株的空白对照组。结果如图4所示，在ph6～9范围内，芽孢杆菌hy-1对正己烷均有较高的降解率；尤其是ph＝6～7时，芽孢杆菌hy-1对正己烷降解率达到最佳(96％以上)。同时芽孢杆菌hy-1的生长量和产生的co2值也有与正己烷降解率一致的趋势(ph＝9时，co2量较少可能是由于碱液吸收了其中一部分)。

实施例5：温度对芽孢杆菌hy-1降解正己烷的影响

在初始正己烷浓度为150mg/l的无机盐培养基中，接入实施例2方法制备的菌液，使各平行样中的初始菌体浓度以od600计为0.01，ph＝7。将各个样品分别置于温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃摇床中恒温振荡培养(摇床转数均为160r/min)，培养24h后取样，测反应液中正己烷降解率和od值，实验过程中，设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。由图5可知，在20～35℃温度范围内，芽孢杆菌hy-1对正己烷均有较高的降解率；尤其是在25～30℃温度范围时，芽孢杆菌hy-1对正己烷降解率达到最佳(98％以上)，同时芽孢杆菌hy-1的生长量和产生的co2值也有与正己烷降解率一致的趋势。

实施例6底物浓度对芽孢杆菌hy-1降解正己烷的影响

在适宜的培养条件(ph＝7，t＝30℃)下，研究芽孢杆菌hy-1菌株对不同浓度正己烷的降解。在新鲜无机盐培养基中加入不同浓度的底物正己烷，使底物初始浓度分别为155、470、770、1050、1600mg/l，分别接种实施例2方法制备的菌液，使各平行样中的初始菌体浓度以od600计为0.01，以不接菌液为空白。在30℃、转数为160r/min的摇床中培养，定时取样测定芽孢杆菌hy-1的od600和正己烷浓度，实验过程中，设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。最终结果见图6和图7，由图6可知芽孢杆菌hy-1在正己烷浓度770mg/l以下时可以几乎完全将正己烷转化为co2和h2o，正己烷浓度达到770mg/l时，芽孢杆菌hy-1对正己烷的降解率达到90％左右便不再降解，正己烷浓度超过770mg/l时，芽孢杆菌hy-1对正己烷的降解率随着正己烷浓度增大而下降，降解时间也趋长。由图7可知，芽孢杆菌hy-1在不同正己烷浓度下的降解率达到最高时，菌量也趋于稳定。

实施例7：芽孢杆菌hy-1对不同碳源底物的降解能力

接种实施例2方法制备的芽孢杆菌hy-1菌液至除正己烷之外的其他底物(加入浓度见表1)，使初始菌体浓度以od600计为0.01，ph＝7，t＝30℃；发现该菌株对正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、石油醚、乙醇有不同程度的降解能力，具体情况见下表1。

表1:hy-1对不同碳源的降解能力

实施例8模拟生物滴滤塔处理正己烷废气进出口浓度及去除率

将实施例2方法培养制备的od600＝0.2的芽孢杆菌hy-1菌液接种至生物滴滤塔中(参见张定丰，房俊逸，叶杰旭等.生物滴滤塔净化多组分废气的研究[j].环境科学，2013.)，接种量为2l，温度为30℃，营养液(即无机盐培养基)喷淋量为6l·h^-1，每隔2d更换一次营养液，其ph采用0.5mol/l的naoh水溶液调节以维持在6～8之间，填料为拉西环。挂膜启动过程中停留时间为36s，正己烷进气浓度为200mg/m³。

经过20天的挂膜启动后，正己烷去除率达93％以上，结果如图8所示。第21天，开始加入混合废气(混合废气成分为100mg/m³正己烷、100mg/m³乙酸乙酯、100mg/m³乙酸丁酯、100mg/m³正丁醇、80mg/m³乙醇、80mg/m³石油醚)，正己烷去除率可达95％以上，乙酸乙酯、乙酸丁酯去除率可达95％以上，正丁醇去除率可达85％以上，乙醇、石油醚去除率可达40％以上，结果如图9中a、b、c、d、e、f所示。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>芽孢杆菌hy-1及其降解有机污染物的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1389

<212>dna

<213>芽孢杆菌(bacillussp.)

<400>1

accaccgacttgctggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggccc60

gggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcatgtag120

gcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggttttatgggattggcttgacctcgcg180

gtcttgcagccctttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggca240

tgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtg300

cccaactaaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaac360

atctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaagggg420

aacgctctatctctagagttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgc480

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agtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgctttaatgcgttagctgcagcactaaagg600

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tcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacaggccaaaaagccgcctt720

cgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccgcttt780

tctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctt840

tcacatcagacttaagaaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggataacgc900

ttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttagg960

taccgtcaaggtacgagcagttactctcgtacttgttcttccctaacaacagagttttac1020

gacccgaaagccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcgga1080

agattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccg1140

atcaccctctcaggtcggctatgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactag1200

ctaatgcaccgcgggcccatctgtaagtgatagccgaaaccatctttcaatcatctccca1260

tgaaggagaagatcctatccggtattagcttcggtttcccgaagttatcccagtcttaca1320

ggcaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctaacgtcatagaagcaagcttcta1380

atcagttcg1389