人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体及应用的制作方法

本发明属于免疫学领域，涉及一种人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。
背景技术：
：肺炎支原体(m.pneumonia，mp)是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。其一年四季均可发生，但多在秋冬时节。支原体肺炎的临床表现和胸部x线检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部x线检查无法做出诊断。若要明确诊断，需要进行病原体的检测。目前检测呼吸道中肺炎支原体的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的pcr技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有pcr抑制剂，从而影响扩增的效果。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。以抗体为基础的免疫学检测已成为人体病原微生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(ria)、酶免疫分析(eia)、荧光免疫分析(fia)、化学发光免疫分析(cia)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、elisa检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中elisa检测试剂盒、免疫胶体金试纸条等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的elisa检测方法、胶体金检测方法等的基础。抗原成分的选择是检测特异性的关键。研究表明，由一种尖端样结构的特殊细胞吸附器黏附于人体细胞是mp感染的第一步，这种特殊的细胞吸附器是由多种黏附蛋白组成的，包括p1，p30，p116，hmvi-3等，其中序列保守性最高的p1与p30是主要黏附因子。layh-schmitt等发现缺失p1或p30蛋白的肺炎支原体将失去黏附上皮细胞的能力而成为无毒株，因此，选择p1或p30蛋白作为特异性高的新的抗原成分进行研究是目前的热点。pl黏附蛋白是良好的免疫原，可诱发机体产生免疫应答，对p1基因进行序列分析研究发现，其中含有较多的终止密码子uga，因此对肺炎支原体的p1全长进行表达是根难实现的，片段表达是解决问题的关键。综上，p1以其良好的保守性与表面可及性使其成为抗原检测的良好标的物。利用生物信息学及免疫信息学软件对p1基因序列分析，去除与其它细菌相似性高的基因序列，使其与其它细菌抗原的交叉性降低，将进一步保证p1蛋白的特异性，从而可利用其制备高特异性单克隆抗体。本研究选用具有种间特异性的表面蛋白p1作为抗原，制备特异性良好的单克隆抗体，并将其应用于制备肺炎支原体免疫层析检测试纸条。技术实现要素：为了解决
背景技术：
中存在的上述技术问题，本发明提供了一种特异性强、敏感度高以及结果清晰易于判断的人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体及应用。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种产生人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述产生人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株是由中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏的保藏号是保藏编号cctccno：c2017210的杂交瘤细胞株mp-13#。一种产生人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)重组人肺炎支原体p1蛋白的制备：对人肺炎支原体表面蛋白p1基因进行生物信息学分析，所述人肺炎支原体表面蛋白p1的ncbi蛋白质数据库中的accessionnumber为aak92040.1，结合gc含量、密码子偏爱性、mrna二级结构、rna不稳定基序以及mrna自由能稳定性，优化人肺炎支原体表面蛋白p1的dna编码序列，同时在人肺炎支原体表面蛋白p1的dna编码序列的5’引入酶切位点ndei、在人肺炎支原体表面蛋白p1的dna编码序列的3’端引入终止信号taa和酶切位点ecori后化学合成全基因序列，所述化学合成的全基因序列连于载体puc57上，记为p1’；其基因全序列及编码的氨基酸序列如序列表所示；将p1’按常规方法克隆入原核表达载体pet-28a(+)，用iptg诱导重组大肠杆菌表达，用ni2+亲和层析法纯化可溶性重组人肺炎支原体p1蛋白；2)筛选抗人肺炎支原体表面蛋白阳性杂交瘤细胞株：a)制备免疫脾细胞：以步骤1)所制重组人肺炎支原体p1蛋白为抗原，免疫8周龄的balb/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照；初次免疫抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点注射免疫小鼠，100μg/小鼠；之后间隔三周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第二次免疫，以后间隔2周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第三次免疫；第三次免疫15天后尾静脉采血，检测抗血清效价；取小鼠脾脏，用rpmi-1640洗液冲洗后，用吸有5mlrpmi-1640培养基注射器针头穿刺脾脏小心的洗出脾细胞，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，离心洗涤两次；用rpmi-1640培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用；b)细胞融合：将含1×108个脾细胞的悬液和含1×107个骨髓瘤细胞的悬液混合，补加培养基洗液至40ml，充分混匀；1200rpm离心5分钟，弃去上清；使细胞团块松散均匀呈糊状；取出已配好的50％peg(mw1450)、rpmi-1640洗液，放在37℃水浴中，预温备用；吸取50％的peg0.8ml，缓慢加入离心管边加边搅拌，时间控制在60秒±5秒；然后再用60秒的时间逐渐加入40ml预热好的rpmi-1640洗液，使peg稀释而失去促融作用；室温离心融合细胞，1000rpm离心5min，弃上清；加入hat培养液，轻轻吹吸、重悬沉淀细胞；将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，50μl/孔，然后将培养板置37℃、5％co2的培养箱中培养；c)阳性克隆的筛选和克隆化培养：融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理；融合后第7d用ht培养液全换液；换液后第二天，吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测；将检测到有强阳性的孔，用有限稀释法进行亚克隆和克隆，经过3次克隆化操作后，所有的克隆化细胞孔检测阳性率为100％，即可确定已获得了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。一种人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株mp-13#分泌的单克隆抗体。一种制备人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)对可产生人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行扩大培养，获取含单克隆抗体的细胞培养液上清；2)以呼吸道病原菌分别包被酶标板，对所筛抗体的特异性进行elisa检测，淘汰与这些病原体有阳性反应的单克隆抗体，筛选出合格的细胞株；所述呼吸道病原菌包括嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、鲍曼不动杆菌、副流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、人肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌以及假丝酵母菌；对筛选得到的杂交瘤细胞按常规腹水体内诱生方法制备单抗腹水，并用proteinasepharose亲和层析法进行抗体纯化，既得人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体。人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体在检测人肺炎支原体中的用途，优选的，是在制备检测人肺炎支原体的试剂中的应用，更优的是在制备检测人肺炎支原体的免疫层析检测试纸条中的应用；最优的，是在制备检测人肺炎支原体的免疫层析检测试纸条中的应用；所述杂交瘤细胞株mp-13#分泌得到的人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体是标记单抗。一种检测人肺炎支原体的免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述检测人肺炎支原体的免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜检测层以及结合垫；所述结合垫上喷涂有由杂交瘤细胞株mp-13#分泌得到的人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体的胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗p1蛋白多克隆抗体的检测线。一种检测人肺炎支原体的免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)硝酸纤维素膜检测层的制备：1.1)抗p1蛋白多克隆抗体的制备:a)采用重组人肺炎支原体p1蛋白对新西兰纯种兔进行免疫，随后进行间接elisa法检测血清抗体水平；b)用ge-hitrapproteinahp预装柱对多克隆抗体进行纯化提取，制得抗p1蛋白多克隆抗体1.2)包被:将抗p1蛋白多克隆抗体稀释至2.0mg/ml，羊抗鼠igg抗体稀释至0.3mg/ml，将稀释好的抗p1蛋白多克隆抗体装入划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的羊抗鼠igg装入划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.5cm；将喷好的硝酸纤维素膜37℃真空干燥12h以上，4℃密封干燥保存；储存备用；2)结合垫的制备：2.1)胶体金溶液的制备：该检测试纸条使用的胶体金是通过柠檬酸三钠还原法制备的；2.2)胶体金标记由杂交瘤细胞株mp-13#分泌得到的人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体的制备、纯化及浓缩；2.3)胶体金标记由杂交瘤细胞株mp-13#分泌得到的人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体的负载；3)样品垫的制备：配制样品垫处理液；取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少2h，再置于真空干燥箱内37℃干燥后，裁剪，制得样品垫，室温密封干燥保存；4)吸水垫的制备：将吸水纸裁剪，即为吸水垫；5)底板的制备：将pvc板裁剪，即为底板；6)将硝酸纤维素膜检测层、结合垫、样品垫、吸水垫以及底板根据现有技术进行组装。本发明具有以下优点和效果：首先，本发明采用基因优化等方式成功获得了可溶性的重组p1蛋白，蛋白结构天然，是作为免疫源制备抗体的良好材料。其次，本发明所得到的单克隆抗体可特异性识别菌体p1蛋白的胞外区，与其他呼吸道常见病原体无交叉反应。最后，用7株人肺炎支原体菌株和17株非人肺炎支原体标准菌株(包含绝大部分呼吸道常见病原体)进行的特异性实验，结果显示本发明的试剂盒具有良好的特异性和稳定性，其可检出所有所试的人肺炎支原体菌株，而与所有非人肺炎支原体标准菌株均无交叉反应。其次，敏感性实验结果表明本发明试剂盒的检测敏感性为1×104cfu/ml，明显高于微生物传统检测方法，并且具有快速、高效等优点。附图说明图1是人肺炎支原体免疫层析检测试纸条的结构示意图；其中：1-样品垫；2-结合垫；3-检测层；4-检测线；5-质控线；6-吸水垫；7-硬质聚氯乙烯背底板。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1重组人肺炎支原体表面蛋白p1及其多克隆抗体的制备(1)人肺炎支原体p1基因的克隆表达对人肺炎支原体表面蛋白p1(其ncbi蛋白质数据库中的accessionnumber为aak92040.1)基因进行生物信息学分析，结合gc含量、密码子偏爱性、mrna二级结构、rna不稳定基序、mrna自由能稳定性等考虑，优化其dna编码序列，同时在其5’引入酶切位点ndei、3’端引入终止信号taa和酶切位点ecori后化学合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段连于载体puc57上)，记为p1’。其基因全序列及编码的氨基酸序列如序列表所示。将含有该段人工合成的dna片段的载体puc57用ndei及ecori进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用ndei及ecori对载体pet-28a(+)进行双酶切，并按常规方法将经双酶切后获得的p1’基因连入pet-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌top10，构建pet-p1’表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组p1-his融合蛋白。(2)重组人肺炎支原体p1蛋白的纯化鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态e.colibl21(de3)plyss中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pet-p1’转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mllb培养基中，于37℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃培养至od600＝0.6时，加入1mol/liptg至终浓度为0.6mmol/l，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导6h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mlbuffera(50mmna3po4，0.5mnacl；ph7.4)洗涤3次并用50ml上样缓冲液(50mmna3po4，0.5mnacl；5mm咪唑，ph7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：功率50w，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组p1蛋白以溶解形式存在于菌体中。薄层扫描显示，该重组蛋白占细菌总蛋白的30％以上，说明基因优化后获得了较高的表达量。将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用histrapaffinitycolumns(gehealthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组p1蛋白的纯化。具体方法如下：连接层析系统，该系统包括进样管、蠕动泵、层析柱及紫外检测器(上海沪西分析仪器厂，型号hd1)，柱体积为2ml，预热紫外检测仪30min左右至读数稳定；校对t％：调节光亮旋钮至显示100％；旋转灵敏度至合适位置，一般用0.2a；以上样缓冲液平衡层析系统，至读数稳定后旋转“调零”至显示“000”；上蛋白样品，流速控制在5ml/min以内，收集穿透液；用上样缓冲液洗去未结合的蛋白，此过程中记录读数，直到读数不再变化为止，收集洗脱液；用buffera+10mm咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；用buffera+20mm咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；用buffera+40mm咪唑洗脱，收集洗脱峰；用buffera+100mm咪唑洗脱，收集洗脱峰；用buffera+150mm咪唑洗脱，收集洗脱峰；取各洗脱峰样品100ul进行sds-page电泳；结果发现，目标蛋白在100mm咪唑时被洗脱下来，纯度在90％以上，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.5mg/ml，备用。至此制得重组人肺炎支原体表面蛋白p1。(3)抗p1蛋白多克隆抗体的制备1)新西兰纯种兔的免疫将实施例1所制重组p1蛋白与福氏完全佐剂混合，乳化后作为免疫原免疫雄性新西兰兔2只，每只兔子皮下注射总量为2ml，抗原总量为2mg/只。后每隔两周用重组p1蛋白与福氏不完全佐剂形成的乳化液免疫一次，共免疫5次，抗原用量与初次免疫相同。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37℃1小时，然后放冰箱4℃过夜，隔天取血清。2)多克隆抗体效价的测定以重组p1蛋白为包被抗原，包被浓度为10μg/ml，每孔包被100μl，利用间接elisa法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800；elisa板包被牛血清白蛋白作为阴性对照，用酶联检测仪测定od450，满足p/n值＞2.1为阳性。结果显示2只兔子的血清抗体效价均达到1：102400，说明免疫效果较好。3)多克隆抗体的提取用ge-hitrapproteinahp预装柱，按说明书纯化抗体，具体操作如下：1.取5ml抗血清，加入0.5ml1mtris(ph8.0)调节到ph8.0，20000g离心20min除去沉淀。2.上柱后用10倍柱体积buffera(100mmtris-cl，ph8.0)洗涤后，再用10倍柱体积bufferb(10mmtris-cl，ph8.0)洗涤。3.用大约三倍柱体积的igg洗脱缓冲液(100mmglycine，ph3.0)洗脱igg。(收集管内先预装0.1mligg-中和缓冲液(1mtris-cl，ph8.0)，每管装0.9ml洗脱液)4.用50倍体积tris(10mmtris-cl，ph8.0)进行透析。5.超滤浓缩后，调整浓度为1mg/ml，-70℃保存备用。至此制得抗p1蛋白多克隆抗体。实施例2人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体mp-13#的制备1)动物的免疫以实施例1所制重组人肺炎支原体表面蛋白p1为抗原，免疫8周龄的balb/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照。初次免疫抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点注射免疫小鼠，100μg/小鼠。之后间隔三周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第二次免疫，以后间隔2周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第三次免疫。第三次免疫15天后尾静脉采血，检测抗血清效价。2)抗血清效价检测抗血清效价采用间接elisa方法：用pbs(8.5g/lnacl，1.4g/lna2hpo4，0.2g/lnah2po4，ph7.4)稀释抗原浓度至3μg/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃孵育2h或者4℃过夜。用pbst(8.5g/lnacl，1.4g/lna2hpo4，0.2g/lnah2po4，0.5％(v/v)tween-20，ph7.4)洗板3次之后拍板。1％的牛血清白蛋白溶于pbs溶液中，250μl/孔，37℃封闭1h或者4℃过夜。用pbst洗板3次之后拍板。4只免疫鼠血清用pbs梯度稀释加入对应孔中，100μl/孔，空白对照为pbs溶液，阴性对照为免疫前小鼠血清37℃包被1h后洗板。hrp标记的羊抗鼠igg以1：3000倍数稀释加入，100μl/孔，37℃包被1h后洗板。每孔加新鲜配制的tmb显色底物溶液100μl，37℃作用10min后每孔加入1m盐酸100μl终止反应，用酶联检测仪测定od450nm值，读数并观察结果。选择效价最高(效价51200)，第三次免疫间隔一个月后加强免疫，5天后取小鼠脾细胞进行细胞融合。3)sp2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养提前对冻存的骨髓瘤细胞(sp2/0)进行复苏，将液氮冻存的骨髓瘤细胞快速取出后，置于37℃水浴中轻微晃动使其迅速融化，注意冻存管口不能碰到水，以免污染，然后将细胞转移到含2mlrpmi-1640完全培养基(含20％胎牛血清的rpmi-1640培养基，胎牛血清购自山西润生大业生物材料有限公司)的24孔板中，放入37℃，5％co2培养箱中培养半个小时，待细胞全部贴壁生长时，及时换液，以后每隔3天传代一次，并调整细胞使其处于最适生长密度，当细胞达到一定活性，计数，准备进行融合。细胞融合前2天对细胞进行1比4传代，用新鲜培养基调整每瓶细胞浓度为1×105/ml。4)饲养细胞的制备4.1)将balb/c小鼠眼球取血之后拉颈处死，完全浸泡于75％酒精中5min，移入超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。4.2)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，用镊子，小剪刀小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心剥去脾脏上附带的脂肪、结缔组织等，加入rpmi-1640培养基(购自hyclone，货号sh30809.01)5ml，用吸有5mlrpmi-1640培养基的注射器的针头穿刺脾脏，小心的洗出脾细胞，然后过筛，将脾脏细胞悬液加入10ml离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，用rpmi-1640培养基离心洗涤两次。4.3)用5mlhat培养液轻轻将细胞重悬并混和均匀，计数，补加hat培养液至细胞浓度为1×105/ml。4.4)将细胞悬液滴入96孔细胞培养板内，130μl/孔，放入37℃、5％co2培养箱中培养。5)免疫脾细胞悬液的制备5.1)加强免疫5天后，选血清效价最高的balb/c小鼠，摘除眼球，放血，收集并分离血清作为抗体检测的阳性对照。5.2)小鼠断颈处死后浸泡于75％酒精中5min，取出小鼠放在无菌超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。5.3)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，再用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心去除脂肪和结缔组织。5.4)用rpmi-1640洗液冲洗后，加入新的rpmi-1640洗液，用吸有5mlrpmi-1640培养基的注射器的针头穿刺脾脏小心的洗出脾细胞，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，离心洗涤两次。5.5)用rpmi-1640培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用。6)sp2/0骨髓瘤细胞悬液的制备6.1)取2瓶t75培养瓶培养好的骨髓瘤细胞(融合前一天换液，融合时细胞应处于对数生长期)，收集于50ml离心管中。6.2)1000rpm离心5分钟，弃上清。6.3)沉淀中加入30mlrpmi-1640洗液，轻轻重悬，混匀，同法再离心洗涤一次。6.4)用10mlrpmi-1640培养液轻轻将脾细胞重悬并混和均匀，计数，备用。7)细胞融合7.1)将含1×108个脾细胞的悬液和含1×107个sp2/0骨髓瘤细胞的悬液混合于一支50ml的离心管内，补加培养基至40ml，充分混匀。7.2)1200rpm离心5分钟，弃去上清，尽量去上清。7.3)用手轻轻弹离心管底，使细胞团块松散均匀呈糊状。7.4)从4℃冰箱中拿出已配好的50％peg(mw1450)、rpmi-1640洗液，放在37℃水浴中，预温备用。7.5)用1ml吸管吸取50％的peg(mw1450)0.8ml，缓慢加入离心管边加边搅拌，时间控制在60秒。7.6)然后再用60秒的时间逐渐加入40ml预热好的rpmi-1640洗液，使peg稀释而失去促融作用。7.7)1000rpm离心5min，弃上清。7.8)加入400mlhat培养液(购自sigma，货号h0262)，轻轻吹吸、重悬沉淀细胞。7.9)将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，50μl/孔，共铺20块培养板，然后将培养板置37℃、5％co2的培养箱中培养。8)阳性克隆的筛选和克隆化培养融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理。融合后第7d用ht培养液全换液(ht，50×，购自sigma，货号h0137)。换液后第二天，吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测。以人肺炎支原体菌体(atcc15531，1×108个菌体/孔)为包被抗原，采用间接elisa法检测。用酶联检测仪测定od450，满足p/n值＞2.1为阳性。将阳性孔再次用ht培养基全换液，第二天再次elisa检测阳性，选取连续阳性的克隆孔进行2-3次亚克隆，筛选出单克隆杂交瘤细胞。亚克隆具体步骤：①吹散并混匀阳性融合孔杂交瘤细胞，测定细胞浓度；②提前制备饲养细胞，并悬于ht培养基中，130ul/孔，铺到96孔板中，然后将培养板置37℃、5％co2的培养箱中备用；③取阳性融合孔杂交瘤细胞，平均分散到步骤②的96孔板中；④将培养板置37℃、5％co2的培养箱中培养7d；⑤用elisa筛选阳性单集落孔，再次亚克隆；⑥连续亚克隆2—3次之后，可使亚克隆细胞集落孔均为阳性，且数值相近，即获得单克隆杂交瘤细胞；对单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，获取含单克隆抗体的细胞培养液上清。以人嗜肺军团菌(atcc33152，1×108个菌体/孔)、铜绿假单胞菌(atcc27853，1×108个菌体/孔)、卡他莫拉菌(atcc25240，1×108个菌体/孔)、鲍曼不动杆菌(atcc19606，1×108个菌体/孔)、副流感嗜血杆菌(atcc7901，1×108个菌体/孔)、流感嗜血杆菌(atcc49247，1×108个菌体/孔)、化脓性链球菌(atcc19615，1×108个菌体/孔)、金黄色葡萄球菌(atcc25923，1×108个菌体/孔)、人肺炎链球菌(atcc49619，1×108个菌体/孔)、肺炎克雷伯菌(atcc700603，1×108个菌体/孔)、阴沟肠杆菌(atcc13047，1×108个菌体/孔)、大肠埃希菌(atcc25922，1×108个菌体/孔)、假丝酵母菌(atcc10231，1×108个菌体/孔)等呼吸道病原菌分别包被酶标板，对所筛抗体的特异性进行elisa检测，淘汰与这些病原体有阳性反应的单克隆抗体。此步共筛选出12株合格的细胞株。9)腹水制备与细胞保藏对最后筛选出的12株阳性单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养。常规腹水体内诱生方法制备单抗腹水。(1)mab的westernblot检测：采用常规westernblot实验方法，测定腹水在1：2000稀释度下的特异性，结果显示该12种抗体均只与人肺炎支原体全细胞蛋白中的p1蛋白结合。(2)抗体纯化及效价测定：腹水用proteina亲和层析法进行纯化，步骤如下：用ge-hitrapproteinahp预装柱，按说明书纯化抗体，具体操作如下：a.取5ml杂交瘤上清，加入0.5ml1mtris(ph8.0)调节到ph8.0，20000g离心20min除去沉淀。b.上柱后用10倍柱体积buffera(100mmtris-cl，ph8.0)洗涤后，再用10倍柱体积bufferb(10mmtris-cl，ph8.0)洗涤。c.用大约三倍柱体积的igg洗脱缓冲液(100mmglycine，ph3.0)洗脱igg。(收集管内先预装0.1mligg-中和缓冲液(1mtris-cl，ph8.0)，每管装0.9ml洗脱液)d.用50倍体积pbs(8.5g/lnacl，1.4g/lna2hpo4，0.2g/lnah2po4，ph7.4)进行透析。e.超滤浓缩后，以pbs调整浓度为1mg/ml，-70℃保存备用。纯化后的12种抗体经倍比稀释后用间接elisa法测定效价。抗体经sds-page分析纯度均在95％以上，elisa效价均在1：1000000以上。纯化的抗体调整浓度为1mg/ml后，-70℃保存备用。将此12种抗体分别作为胶体金试纸条的金标抗体，进行配对实验，筛选出最佳组合。最终经过多次实验，确定被命名为mp-13#的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体优选为金标抗体。将此抗体命名为单克隆抗体mp-13#。分泌该抗体的杂交瘤细胞株已于2018年10月15日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：杂交瘤细胞株mp-13#，保藏编号cctccno：c2017210；地址：中国武汉武汉大学。实施例3人肺炎支原体免疫层析检测试纸条人肺炎支原体免疫层析检测试纸条(如图1所示)由样品垫1、结合垫2、检测层3、检测线4、质控线5、吸水垫6、硬质聚氯乙烯背底板7组成；硝酸纤维素膜检测层3粘贴在硬质聚氯乙烯背底板7上面，在硝酸纤维膜检测层3上面靠左侧由下而上依次粘贴有结合垫2、样品垫1，吸水垫6设置在硝酸纤维膜检测层3上面靠右侧的位置。结合垫2由玻璃纤维素膜制成，该结合垫2上喷涂的是胶体金标记的单克隆抗体mp-13#(杂交瘤细胞株mp-13#，保藏编号cctccno：c2017210分泌)。硝酸纤维膜检测层3上面靠左侧的是检测线4，质控线5位于右侧，两条线的间隔距离是5mm，检测线4和质控线5分别喷涂的是抗p1蛋白多克隆抗体和羊抗鼠抗体。当被检测样本中含有人肺炎支原体时，人肺炎支原体可分别先与金标抗人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体结合，然后在层析作用下与相应检测线上的抗体结合而聚集后形成肉眼可见的色带，进而根据显色结果进行判定。实施例4人肺炎支原体免疫层析检测试纸条的制备方法人肺炎支原体免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：(一)硝酸纤维素膜检测层的制备将硝酸纤维素膜(材质为赛多利斯cn140)剪成30cm×2cm大小。将用pbs缓冲液(8.5g/lnacl，1.4g/lna2hpo4，0.2g/lnah2po4，ph8.7)将抗p1蛋白多克隆抗体稀释至终浓度2.0mg/ml，羊抗鼠igg(购自北京赛驰生物科技有限公司)抗体稀释至0.3mg/ml，将稀释好的抗p1蛋白多克隆抗体装入划膜仪(上海金标生物科技有限公司xyz三维划膜喷金仪，型号hm3030)喷头3中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的羊抗鼠igg装入划膜仪喷头1中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与检测线间距为0.5cm。将喷好的硝酸纤维素膜37℃真空干燥12h以上，4℃密封干燥保存。储存备用。(二)结合垫的制备1)胶体金溶液的制备该产品使用的胶体金是通过柠檬酸三钠还原法制备的，具体方法如下：a)往250ml的圆底烧瓶中倒入99ml超纯水，再加入1ml浓度为1％的氯金酸(终浓度为0.01％)。圆底烧瓶放于油浴锅中，设置温度100℃，加热到100℃沸腾。b)迅速加入1.5ml浓度为1％的柠檬酸三钠后继续加热10min，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，停止加热，水浴搅拌冷却。c)将冷却后的胶体金溶液使用紫外分光光度计进行400-600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰型和峰宽。该胶体金在520～530nm处有单一吸收峰。2)胶体金标记mp-13#的制备、纯化及浓缩a)取10ml胶体金溶液放入已加入搅拌子的50ml圆底烧瓶中，加入0.2m浓度的碳酸钾溶液20ul后放置在磁力搅拌器开始搅拌5分钟(转速以不产生气泡为准)，按终浓度10ug/ml的量缓慢滴加待标记抗体mp-13#(滴速以1毫克蛋白5分钟滴完为准)后，低速搅拌45分钟。b)匀速加入peg(纯水配制的10％浓度的peg20000)200ul，继续搅拌15分钟后，4℃保存备用。c)取标记好的胶体金液分装到2ml离心管中，2500g离心5分钟，除去聚沉。上清以15000g离心30分钟，弃上清。以金液原体积3/40的量的洗涤液重悬沉淀，4℃保存备用。(洗涤液配方：0.01mtris，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，1％(v/v)吐温20，1％bsa，ph8.7)3)金标mp-13#的负载a)将结合垫(购自上海金标生物科技有限公司，型号为玻璃纤维膜cb08)浸泡在处理液中浸泡2h，取出后，37度真空干燥12小时。保存在干净无尘且干燥的地方备用。(结合垫处理液配方：20mmtris，0.3％酪蛋白，1％(v/v)吐温20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，ph8.7)b)喷金：在处理好的结合垫上用划膜喷金仪(上海金标公司的xyz三维划膜喷金仪hm3030)喷涂金标抗体，喷金量为8ul/cm，37度真空干燥12小时，干燥洁净放置备用。(三)样品垫的制备配制样品垫处理液(20mmtris，0.3％酪蛋白，1％(v/v)吐温20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，ph8.7)。取玻璃纤维素膜(购自上海金标生物科技有限公司，型号为玻璃纤维膜cb08)一张，剪成4cm×1.5cm大小。将其在样品垫处理液中浸泡至少2h，再置于真空干燥箱内37℃干燥后，制得样品垫，室温密封干燥保存。(四)吸水垫的制备将吸水纸(购自上海金标生物科技有限公司，型号为ch37的)裁剪成4cm×1.5cm大小，即为吸收垫。(五)底板的制备将pvc板(购自上海金标生物科技有限公司，型号为sm31-40)裁剪成4cm×6cm大小，即为底板。(六)组装(1)将结合垫、样品垫、检测层及其它辅料按照图1所示结构依次粘贴，组装时，先把切好的试纸条装配到完好的pvc卡中，再用压卡机进行压卡，装条时应注意检查条有无划痕污渍，宽度是否符合要求；pvc卡外观应清洁，平整，无变形，底面配套性好，压卡应注意调节松紧度，避免将卡压破或变形。注：析检测试纸条长度60mm，宽4mm。样品垫15mm，结合垫6mm，硝酸纤维素膜20mm，吸水纸25mm。样品垫与结合垫结合2mm，结合垫与nc膜结合2mm，吸水垫与nc膜结合2mm。检测线距底板左边缘24mm，质控线距底板左边缘29mm。(2)裁剪：将组装好的试纸于自动剪切机中裁剪成4mm宽的试纸条即为成品。实施例5人肺炎支原体免疫层析检测试纸条的使用方法待检样本的预处理：按常规方法获得待检者的咽拭子，将其插入装有500μl生理盐水的软质塑料管中，挤压塑料管壁，使拭子上的样品充分溶解。将样品进行超声破碎(宁波新芝jy96-iin型超声波细胞粉碎机，30％功率，15min)后制成破碎液。检测：取破碎液约100μl滴在本发明试纸的样品垫上，15min后观察结果。结果判定：在质控线、检测线上均出现红色时，为人肺炎支原体阳性，即样本中含有人肺炎支原体，检测线不出现红色为人肺炎支原体阴性，即样本中不含有人肺炎支原体。若质控线未出现红色线，则试纸无效。实施例6人肺炎支原体免疫层析检测试纸条的特异性和敏感性测定1)特异性测定为了验证本发明的人肺炎支原体免疫层析检测试纸条的特异性，按照实施例3及实施例5所述的试纸条组成和使用方法对7株人肺炎支原体菌株及17株非人肺炎支原体标准菌株进行了检测，见表1。结果表明，本发明试剂盒对所有7株人肺炎支原体菌株的检测结果均为阳性，而对其他17株呼吸道常见病原微生物的检测结果均为阴性。该试剂盒显示出良好的特异性。表1菌株名称检测结果结果菌株名称检测结果结果肺炎支原体atcc15531阳性人流感嗜血杆菌atcc49247阴性人肺炎支原体atcc39505阳性化脓性链球菌atcc19615阴性人肺炎支原体atcc29342阳性金黄色葡萄球菌atcc25923阴性人肺炎支原体atcc15293阳性人肺炎链球菌atcc49619阴性人肺炎支原体atcc15492阳性肺炎克雷伯菌atcc700603阴性人肺炎支原体atcc15377阳性阴沟肠杆菌atcc13047阴性人肺炎支原体atcc29343阳性大肠埃希菌atcc25922阴性嗜肺军团菌atcc33152阴性假丝酵母菌atcc10231阴性铜绿假单胞菌atcc27853阴性甲型流感病毒atccvr-1743阴性卡他莫拉菌atcc25240阴性乙型流感病毒atccvr-790阴性鲍曼不动杆菌atcc19606阴性呼吸道合胞病毒atccvr26阴性副流感嗜血杆菌atcc7901阴性腺病毒atccvr-3阴性2)敏感性测定将人肺炎支原体atcc15531菌株接种于oxoid支原体培养基，37℃培养15天后，生理盐水10倍梯度稀释，同时平板计数，得到菌体浓度为108-103cfu/ml的菌体溶液，取100μl菌体溶液，按照实施例3及实施例5所述的试纸条组成和方法将进行检测。结果表明本发明的试纸条的检测敏感性为104cfu/ml。序列表<110>湖北诺美华抗体药物技术有限公司<120>人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体及应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1224<212>dna<213>p1基因序列(artificialsequence)<400>1catatggcgtacggtgaagtaaacggtttcttcaaccctgcttttgtggaaacttatttc60ggcaacactagcgctactggtaccggcaccaacactaccaccaccccgggcatcggcttc120aaaattccggaacagaccggtaccaacaccaccactaaagctgttttcatcaccccgggc180tttgcgtggactccgcaggatgttggcaacttcgtagttacaggcaccactttcaccttc240cagttcggtggttggtttgtaaccttcactgactttatcaagccgtctgctggctacttc300ggtttccaatttaccggctttgatgctactgacgcaacacagagcgcgttcatctgggct360ccatccccgtgggctgcattttctggtacttgggttaactccttcggctctgttgaaaca420gtttgggatttcaaaggtgtatgggcggaccaggctcagaccgatacccagggcacgacc480accactgcgacctctgacgcgtttccagaacacccgaacgctttcgcgttccaggttact540gttgttgaagcaaccgcttacaagccgaacaccaccaccggtcagactcagaccaccaac600actaccccgtactttcattttgttaaaccgaaaaaagttattcagaccgacaaattcgac660gatgacttcaaaaacttcttcgacccgaaccaggtttctaccaaattcagccagaccttc720ggcactgaccacaccacccagccgcagccgcagactttcaagaccactaccccaatcttt780ggtactaccaccggtaacttcactaccgtgttcactggcggcggcgctggtggcggtact840accggcaccggtcagactggcgttgacttcaccccggttgaaaaagtaaccggttggttc900gtgggtcagttcccaactaccaccgacggtaacaccaccactaccaacaacttcgctccg960aacactaacaccggcaacgatgttgtgggtgttggctctttcaccgaaaccaacgcagct1020aaaatgaacgacgacgtagacggtatcgtaagcaccccgtttgccgagttctttgatggt1080gaaggccagactgcagacaccggtccgcagaccgttaaattcaaaactccagaccagatc1140gactttaactccttcttcacccacccagtaaccgactttttcgaccctgttactatgttc1200gtatacgaccagtacatcctcgag1224<210>2<211>405<212>prt<213>p1蛋白序列(artificialsequence)<400>2metalatyrglygluvalasnglyphepheasnproalaphevalglu151015thrtyrpheglyasnthrseralathrglythrglythrasnthrthr202530thrthrproglyileglyphelysileprogluglnthrglythrasn354045thrthrthrlysalavalpheilethrproglyphealatrpthrpro505560glnaspvalglyasnphevalvalthrglythrthrphethrphegln65707580pheglyglytrpphevalthrphethrasppheilelysproserala859095glytyrpheglypheglnphethrglypheaspalathraspalathr100105110glnseralapheiletrpalaproserprotrpalaalaphesergly115120125thrtrpvalasnserpheglyservalgluthrvaltrpaspphelys130135140glyvaltrpalaaspglnalaglnthraspthrglnglythrthrthr145150155160thralathrseraspalapheprogluhisproasnalaphealaphe165170175glnvalthrvalvalglualathralatyrlysproasnthrthrthr180185190glyglnthrglnthrthrasnthrthrprotyrphehisphevallys195200205prolyslysvalileglnthrasplyspheaspaspaspphelysasn210215220phepheaspproasnglnvalserthrlyspheserglnthrphegly225230235240thrasphisthrthrglnproglnproglnthrphelysthrthrthr245250255proilepheglythrthrthrglyasnphethrthrvalphethrgly260265270glyglyalaglyglyglythrthrglythrglyglnthrglyvalasp275280285phethrprovalglulysvalthrglytrpphevalglyglnphepro290295300thrthrthraspglyasnthrthrthrthrasnasnphealaproasn305310315320thrasnthrglyasnaspvalvalglyvalglyserphethrgluthr325330335asnalaalalysmetasnaspaspvalaspglyilevalserthrpro340345350phealagluphepheaspglygluglyglnthralaaspthrglypro355360365glnthrvallysphelysthrproaspglnileasppheasnserphe370375380phethrhisprovalthraspphepheaspprovalthrmetpheval385390395400tyraspglntyrile405当前第1页12