本发明涉及一种饲料中违法添加剂检测用稳定同位素标记溴吡斯的明内标试剂的制备方法，属于饲料质量安全检测用标准物质研发领域。
背景技术：
溴吡斯的明(pyridostigmine，casno.：101-26-8)，是新斯的明的衍生物，为拟胆碱药中的抗胆碱酯酶药。在养殖业中，溴吡斯的明常用于治疗牛羊前胃疾病、动物便秘以及分娩期和产后疾病等，对长期血流不畅造成的神经肌肉衰弱也有良好疗效。溴吡斯的明仅被允许直接给药用作治疗，根据《饲料药物添加剂使用规范》，禁止在饲料中使用。但随着养殖业集约化、规模化发展，溴吡斯的明作为治疗药物，有违法在饲料中滥用和添加用作治疗和预防的安全风险。为此，我国农业部发布了《ny/t3142-2017饲料中溴吡斯的明的测定液相色谱-串联质谱法》，并从2018年6月1日起正式实施。其中，明确提出了使用稳定同位素标记溴吡斯的明-d6作为内标试剂来进行内标法定量。使用该方法可以规范饲料中添加剂药物使用，为监控饲料中溴吡斯的明的使用情况以及饲料质量安全风险评估的深入研究提供技术支持。
本发明所涉及饲料中违法添加剂检测用稳定同位素标记溴吡斯的明内标试剂的研制，能满足我国农业行业标准中关于饲料中违法添加剂监测的需求。目前全球尚未发现有稳定同位素标记溴吡斯的明制备文献，因此，研制稳定同位素标记溴吡斯的明内标试剂对我国饲料质量安全检测和监管工作具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种适用于饲料中违法添加剂检测用稳定同位素标记溴吡斯内标试剂的制备方法。该发明制备路线短，反应条件简单，合成所需原料、中间体简单易得，产品质量能满足农业部所发布行业标准中所需内标试剂的技术要求。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种饲料中违法添加剂检测用稳定同位素标记溴吡斯的明内标试剂的制备方法，该稳定同位素标记溴吡斯的明内标试剂的化学结构如式(i)所示：
其中，(i)中x为12c或13c，y为h或d，*为14n或15n，其合成步骤总路线为：
其中，x为12c或13c，y为h或d，*为14n或15n。
(1)在氮气保护条件下，加入稳定同位素标记n,n-二甲基甲酰胺，在-20℃～0℃条件下，加入酰基化试剂，反应0.5～3小时；得到稳定同位素标记的n,n-二甲氨基甲酰氯，无需处理，直接作为中间体进行下一步反应。
(2)在有机溶剂存在条件下，在氮气保护条件下，加入3-羟基吡啶，搅拌0.5～2小时；将步骤(1)得到的稳定同位素标记的n,n-二甲氨基甲酰氯的有机溶液加入到上述3-羟基吡啶的有机溶液中，在30℃～130℃条件下反应2～12小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，用水淬灭反应，水相用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记得到稳定同位素标记3-(n,n-二甲氨基甲酰氧基)吡啶。
(3)将步骤(2)所得到的稳定同位素标记3-(n,n-二甲氨基甲酰氧基)吡啶溶于有机溶剂中，在-30℃～50℃条件下加入溴甲烷，在室温下反应24～72小时，过滤后用有机溶剂洗涤得稳定同位素标记溴吡斯的明。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：饲料中违法添加剂检测用稳定同位素标记溴吡斯的明内标试剂的制备，方法所使用的制备路线短，反应条件简单温和，合成所需原料、中间体简单易得，产品质量能满足我国农业行业标准中所需内标试剂的技术要求。制备出的稳定同位素标记溴吡斯的明纯度大于98％，同位素丰度大于98％。该结构化合物的制备路线及方法均未有文献报道，研制稳定同位素标记溴吡斯的明内标试剂对我国饲料质量安全检测和监管工作具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例进一步叙述本发明，但它并不是对本发明的范围的任何限制。
实施例1：稳定同位素标记的n,n-二甲氨基甲酰氯-d6的制备
在100ml三口瓶中，在氮气保护下，加入n,n-二甲基甲酰胺-d7(37.5ml)，降温至-5℃，加入氯化亚砜(7.15ml，0.1mol)，并在该温度下搅拌反应1小时；反应液无需处理，直接进行下一步反应。
实施例2：3-(n,n-二甲氨基甲酰氧基)吡啶-d6的制备
在500ml三口瓶中，加入3-羟基吡啶(9.5g，0.1mol)和甲苯(200ml)；加入实施例1中制得的稳定同位素标记的n,n-二甲氨基甲酰氯-d6(16.5ml)，加热至回流搅拌3小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应液用饱和碳酸钠溶液淬灭；水相用乙酸乙酯萃取(3×100ml)，合并有机相，依次用水洗涤(3×100ml)，饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3×100ml)，饱和氯化钠溶液洗涤(3×100ml)，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记3-(n,n-二甲氨基甲酰氧基)吡啶-d6(13.9g，收率81％)。
实施例3：稳定同位素标记溴吡斯的明-d6的制备
在100ml三口瓶中，加入稳定同位素标记3-(n,n-二甲氨基甲酰氧基)吡啶-d6(4g，23mmol)，无水丙酮(25ml)，冷却至-10℃；加入溴甲烷(3g，32mmol)，然后升温至室温，继续反应36小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，残留物用丙酮洗涤后得到稳定同位素标记溴吡斯的明-d6(5.2g，收率85％)；hnmr(dmso-d6，300m)δppm9.35(s，1h)，8.72(d，2h)，8.38(m，2h)，8.26(d，1h)，4.42(s，3h)，msesi+267[m+1]。
13c标记和15n标记的溴吡斯的明合成步骤同上述实施例中稳定同位素标记溴吡-d6的制备路线。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。