一种降解水体中氨氮的微生物菌及其应用的制作方法

本发明属于水环境微生物治理技术领域，具体涉及一种降解水体中氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的粪污转化微生物菌的筛选及应用。

技术背景

随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，由于工业污水排放、畜禽业养殖污水排放、水产养殖污水排放、生活污水排放等引起的水体氨氮污染有加重的趋势，不仅会引起水体中藻类及其它微生物大量繁殖，形成富营养化污染，严重时会引起水中溶解氧的大量消耗，导致水生动物大量死亡，造成生态破坏和一定程度的经济损失。在氨的致死、半致死浓度下，氨可引起养殖动物的肾、脾、甲状腺和血液组织的变化；亚硝酸盐对养殖动物有很强的毒性，严重影响养殖动物的生长、发育。水体中存在的氨氮对养殖的水产品具有一定的毒性，影响了水产品的品质，限制了水产养殖的可持续发展，特别是随着高密度工厂化养殖技术的推广，氨氮污染治理的需求日益突出。

环境保护已成为当前国际关系、经济合作中的一个重要问题，也日益严重地影响着我国国民经济的可持续发展。在我国过去几十年的经济发展中，由于忽视了发展中的环境保护，目前环境状况十分严峻。近年来虽采取了大量控制措施，但环境质量下降的趋势仍在继续。废水的排放量还在增加，2005年全国废水排放总量450亿吨；2006年上半年，全国化学需氧量（cod）排放总量689.6万吨，同比增长3.7％；二氧化硫（so2）排放总量1274.6万吨，同比增长4.2％。目前我国的污水处理率约70％，污水处理达标率更低，即使在污水处理做得最好的广东省，其处理达标率也仅为70％左右，我国的其他广大区域，特别是北方地区，冬天的污水水温（指进生物处理系统时）约在5-15℃，其处理效率比平常还要降低30％以上。

因此养殖污水和生活污水，面临水污染防治方面的问题非常严峻。如何经济、高效地去除水体中无机氮素将成为水污染控制领域的研究重点和热点。传统的脱氮方法主要有物理方法增氧、换水、吸附过滤等，化学方法加过氧化钙、生石灰、偶合剂及生物方法水生植物、硝化菌和光合细菌等微生物。生物脱氮工艺以其操作简单、投资少、成本低、不易造成环境污染，除氮效果也较好等多方面的优点。

生物脱氮方法是指通过微生物的硝化和反硝化作用来脱除水体中的氮素污染。其中硝化作用是指硝化菌将氨氮氧化成硝酸盐氮的过程，包括两个步骤第一步是由亚硝酸菌将氨氮转化为亚硝酸盐，第二步是由硝酸菌从将亚硝酸盐转化为硝酸盐。反硝化作用是指反硝化细菌将硝态氮盐、亚硝态氮盐及其它氮氧化物转变为氮气或氮的其它气态氧化物的生物学过程等。然而，传统生物脱氮也有其自身难以克服的缺点：一方面，亚硝酸细菌为化能自养菌生长速率缓慢导致反应器启动时间长增加了水处理成本，并且亚硝酸细菌对污水组成分、温度等的改变都很敏感。另一方面，硝化过程是在好氧环境中完成的，而反硝化是在缺氧过程中进行的。这使得整个脱氮过程必须经过好氧和缺氧两个环节。因此，人们努力探求新型、效果更好的脱氮微生物。

基于上述分析，本发明提供了一种粪污转化微生物菌降解水体中氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的方法，不仅资源化利用畜禽粪污中营养成分，将畜禽粪污变废为宝，同时对水体中鱼类、虾类、有益微生物等生物没有毒害作用。

技术实现要素：

鉴于上述不足，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，为水环境生物治理技术领域中降解氨态氮、硝态氮和亚硝态氮提供一种新的技术路线。针对上述现有生活污水和养殖污水处理费用昂贵、工艺复杂、占地面积大、不稳定、反映时间长、降解率低的缺陷，提供一种能够去除生活污水和养殖污水中氨态氮、硝态氮和亚硝态氮，同步进行多种反应的微生物菌剂及生产方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种降解水体中氨氮的微生物菌的制备方法，包括如下步骤：

（1）取猪粪在35℃恒温下行间歇震荡，从中分离出乳杆菌属、巨型球菌属、芽孢乳杆菌属、产碱菌属、红球菌属5种微生物菌属，备用；

（2）将5种微生物菌属样品放入由粪污制备的培养基中富集一周，制得富集培养液，吸取1ml富集培养液，加入新鲜异养硝化培养基中摇床培养，得到样品1，对样品1中的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的含量进行检测；

（3）吸取1ml样品1加入50ml粪污制备的培养基中，按步骤（2）的培养方法重复操作两次，得到样品2，对样品2中的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的含量进行检测；

（4）将样品2分别稀释104、105、106，然后分别吸取0.1ml样品稀释液于粪污制备的培养基上涂布分离，挑取单菌落，作为初筛菌株；

（5）将初筛菌株接种于新鲜粪污制备的培养基中摇床培养，结束后进行复筛；

（6）将复筛得到的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮降解率分别达到90%、91%，89%的菌落划线接种在粪污制备的培养基表面，挑出单菌落纯化两次，即得一种降解水体中氨氮的微生物菌。

进一步的，所述粪污制备的培养基由如下方法制得：是以新鲜粪水作为底液，加入硝酸钾3.0g/l、柠檬酸三钠8g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、磷酸二氢钾2g/l、牛肉膏蛋白胨40g/l制备而成。

进一步的，所述步骤（2）中摇床培养条件为30℃下以转速为150r/min培养48h。

进一步的，所述步骤（4）中培养条件为30℃下培养72h。

进一步的，所述步骤（5）中摇床培养条件为30℃下，以150r/min培养72h。

本发明还公开了一种根据上述任意一种方法制备的微生物菌。

一种采用微生物菌降解水体中氨氮的方法，包括以下步骤：

将污水收集池中的污水通入第一降解池，并加入微生物菌剂，充分搅拌后溢流入第二降解池，再次加入微生物菌剂，充分搅拌后溢流入第三降解池，加入微生物菌剂，最后对第三降解池的水质进行检测，直到达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》gb18918-2002的一级a标准后，可排放到农田或者河流。

进一步的，所述第一、第二和第三降解池为串联设计，并且靠溢流串行流动。

进一步的，所述菌剂投加数量为7t/10000m³污水。

进一步的，所述微生物菌剂每周投放一次，同时对水底进行冲击，使污泥翻动。

本发明的有益效果在于：

1、与现有技术相比，本发明在解决养殖污水和生活污水无公害处理的同时，实现了资源循环利用。帮助农户解决处理养殖污水和生活污水难题，减少处理养殖污水和生活污水费用，为农户带来良好的经济效益，建立生物链的循环系统，助力畜牧业可持续发展。

2、粪污实现“零排放”，既能够处理畜禽粪便，又能够处理生活污水，既不排放废水，又不排放废气。

3、生活污水和养殖污水处理费用底、工艺简单、占地面积小、稳定、反映时间短、降解率高。

4、资源化利用畜禽粪污中营养成分，将畜禽粪污变废为宝，同时对水体中鱼类、虾类、有益微生物等生物没有毒害作用。

5、同步进行多种反应的微生物菌剂及生产方法。

附图说明

图1为养殖污水和生活污水处理系统设计方案运行流程示意图。

图2为养殖场循环系统设计方案流程示意图。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作出详尽的说明。以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1

一种降解水体中氨氮的微生物菌及其应用

（1）取猪粪在35℃恒温下行间歇震荡，从中分离出乳杆菌属、巨型球菌属、芽孢乳杆菌属、产碱菌属、红球菌属5种微生物菌属，备用；

（2）制备粪污培养基：取新鲜粪水1l，然后加入硝酸钾3.0g、柠檬酸三钠8g、七水合硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾2g、牛肉膏蛋白胨40g，即制得。

（3）将5种微生物菌属样品放入由粪污制备的培养基中富集一周，制得富集培养液，吸取1ml富集培养液，加入新鲜异养硝化培养基中摇床培养，在30℃下以转速为150r/min摇床培养48h，得到样品1，对样品1中的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的含量进行检测；

（4）吸取1ml样品1加入50ml粪污制备的培养基中，按步骤（3）的培养方法重复操作两次，得到样品2，对样品2中的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的含量进行检测；

（5）将样品2分别稀释10⁴、10⁵、10⁶，分别吸取0.1ml样品稀释液于粪污制备的培养基上涂布分离，培养条件为30℃下培养72h，培养结束后挑取单菌落，作为初筛菌；

（6）将初筛菌株接种于新鲜粪污制备的培养基中以30℃下，以150r/min培养72h摇床培养，结束后进行复筛；

（7）将复筛得到的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮降低明显的菌落划线接种在粪污制备的培养基表面，挑出单菌落纯化两次，即得一种降解水体中氨氮的微生物菌；

（8）将污水收集池中的污水通入第一降解池，并加入微生物菌剂，充分搅拌后溢流入第二降解池，再次加入微生物菌剂，充分搅拌后溢流入第三降解池，加入微生物菌剂，所述微生物菌剂每周投放一次，投加数量为7t/10000m³污水，同时对水底进行冲击，使污泥翻动，最后对第三降解池的水质进行检测，直到达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》gb18918-2002的一级a标准后，可排放到农田或者河流；其中第一、第二和第三降解池为串联设计，并且靠溢流串行流动。

试验例

1测定微生物菌对氨态氮的降解和利用情况

1.1降解力测定

将粪污转化微生物菌接种于粪污制备的培养基，经24h活化后，接种于氨态氮浓度约100mg/l的生活污水和养殖污水，定时取样离心，测定上清液420nm处的吸光值，对照标准曲线确定氨态氮的降解率，具体结果详见表1。

1.2不同温度下对氨氮的降解情况

将经过24h活化后的粪污转化微生物菌悬液1%按的接种量接入粪污制备的培养液，分别放在4℃、10℃、20℃、30℃及37℃条件下培养，定时取样离心后取上清液，于420nm处测定氨态氮的量，确定不同温度下，粪污转化微生物菌对氨态氮的降解能力，具体结果详见表2。

1.3对氨态氮的降解和利用特性

粪污转化微生物菌对氨态氮降解的温度范围为4-45℃，在4℃条件下，经过48h的培养，氨态氮降解率达到90%以上，在最适温度范围（20-37℃），粪污转化微生物菌能在48h内将约100mg/l的氨态氮降解90%以上。同时测定培养液上清液中的硝态氮和亚硝态氮，基本上没有这两种中间产物产生，具体结果详见表3。

表1一种降解水体中氨氮的微生物菌对氨态氮去除效果

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由表1结果可知，在对生活用水加入微生物菌48h后，氨氮浓度从原有的100mg/l降低至2.5mg/l，去除率高达97.5%；而未加入微生物菌的生活污水放置48h后，氨氮浓度仍旧高达96.5mg/l，这说明通过本发明制备得到的微生物菌能有效降低生活用水中的氨氮水平。在对养殖污水加入微生物菌48h后，氨氮浓度从原有的100mg/l降低至8.5mg/l，去除率高达91.5%；而未加入微生物菌的养殖污水放置48h后，氨氮浓度仍旧高达96.3mg/l，这说明通过本发明制备得到的微生物菌能有效降低养殖污水中的氨氮水平。

2测定微生物菌对硝态氮和亚硝态氮的降解和利用

2.1对硝态氮和氨氮降解力测定

分别用硝酸钾和亚硝酸钠使c/n比为10，灭菌后，接入经24h活化的粪污转化微生物菌，接种量3%，每隔一定时间取样，离心后取上清液于220nm和275nm处测定硝态氮的含量，于540nm处测定亚硝态氮的含量，对照标准曲线确定硝态氮和亚硝态氮的降解率。

2.2降解情况

粪污转化微生物菌可在以硝酸钾和亚硝酸钠为氮源的培养基中生长。经过48h培养，可将初始浓度为284mg/l的硝态氮和198mg/l的亚硝态氮生活污水和初始浓度为185mg/l的硝态氮和156mg/l的亚硝态氮养殖污水，分别降解为mg/l与mg/l，降解率分别为和。在二者降解过程中均没有检测到氨氮的积累，以硝态氮为氮源时，亚硝态氮的积累量最多只有0.39%。

表2一种降解水体中氨氮的微生物菌对硝态氮去除效果

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由表2结果可知，在对生活用水加入微生物菌48h后，硝态氮浓度从原有的284mg/l降低至8.2mg/l，去除率高达97.1%；而未加入微生物菌的生活污水放置48h后，硝态氮浓度仍旧高达278mg/l，这说明通过本发明制备得到的微生物菌能有效降低生活用水中的硝态氮水平。在对养殖污水加入微生物菌48h后，硝态氮浓度从原有的185mg/l降低至14.6mg/l，去除率高达92.1%；而未加入微生物菌的养殖污水放置48h后，硝态氮浓度仍旧高达180mg/l，这说明通过本发明制备得到的微生物菌能有效降低养殖污水中的硝态氮水平。

表3一种降解水体中氨氮的微生物菌对亚硝态氮去除效果

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由表3结果可知，在对生活用水加入微生物菌48h后，亚硝态氮浓度从原有的198mg/l降低至8.9mg/l，去除率高达95.5%；而未加入微生物菌的生活污水放置48h后，氨氮浓度仍旧高达194mg/l，这说明通过本发明制备得到的微生物菌能有效降低生活用水中的硝态氮水平。在对养殖污水加入微生物菌48h后，亚硝态氮浓度从原有的156mg/l降低至12.9mg/l，去除率高达91.7%；而未加入微生物菌的养殖污水放置48h后，亚硝态氮浓度仍旧高达152.7mg/l，这说明通过本发明制备得到的微生物菌能有效降低养殖污水中的亚硝态氮水平。

3测定微生物菌的安全性

将粪污转化微生物菌转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，24h离心去掉上清液，用经过充分曝气的自来水将菌体稀释到6*10⁷cfu/ml，选择5个试验浓度，并设置空白对照组（ck）。试验水中的菌株的试验浓度分为100ppm、1000ppm、2500ppm、5000ppm、10000ppm共5个试验组，空白对照组中不加菌液。用来喂养生长20d的草鱼仔鱼，开始16h连续观察，16h后每隔24h观察一次，详细记录鱼的健康和死亡情况，确定粪污转化微生物菌的安全性。

表4一种降解水体中氨氮的微生物菌的安全性测定测试结果

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由表4可知，浓度分为100ppm、1000ppm、2500ppm、5000ppm、10000ppm的五个微生物菌稀释液在对生长20d的草鱼仔鱼进行喂养后，16h内均无一条鱼发生死亡，这说明本发明的微生物菌安全性高，可直接排放到农田或河流，不会对其他生物造成危害与影响。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。