增强CAR-T细胞归巢到实体肿瘤组织能力的试剂及其应用的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种car-t细胞、一种增强car-t细胞归巢到实体肿瘤组织能力的试剂及其应用。
背景技术：
：car-t全称是嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，其在血液系统瘤中取得较好的成绩，但car-t在实体瘤中的效果不如血液系统瘤，其主要原因之一是因为car-t较难进入实体瘤内部，并且实体瘤异质性高，实体瘤靶点往往在正常组织也有所表达，如果car-t细胞不能“精准”的靶向肿瘤组织，存在脱靶风险等安全问题，这些都影响car-t细胞在实体瘤治疗的疗效。因此，提高car-t细胞肿瘤归巢能力和浸润能力很有必要。dpp4又称cd26，是一种具有多种生物学功能的跨膜丝氨酸蛋白酶。膜结合型cd26是t细胞活化的标志物之一，在活化t细胞上的表达量显著增加。作为一种共刺激分子，cd26能够与多种细胞表面或者细胞内的分子相互作用，参与t细胞信号转导过程，cd26对t细胞的影响还处于研究阶段，目前仅有抗cd26抗体对t细胞的活化有较多的研究，但是需要比抗cd3抗体或抗tcr抗体等常规t细胞活化抗体更高的抗体浓度。cd26抑制剂也就是dpp4抑制剂能够抑制dpp4对胰高血糖素样肽(glp)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(gip)等肠促胰岛素的剪切，有效控制血糖，现已成为一种重要的抗糖尿病药物。但是，目前对于dpp4在不同肿瘤中的生物学功能及其作用机制仍不十分明确。针对dpp4能够与多种细胞表面或者细胞内的分子相互作用的特点，为提高car-t细胞肿瘤归巢能力和浸润能力，降低脱靶风险等安全问题，本发明申请利用dpp4抑制剂联合car-t细胞免疫治疗技术提高car-t细胞治疗实体瘤的效果。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种car-t细胞。为实现上述目的，本发明所用以下方案：一种car-t细胞，所述car-t细胞表达包含胞外抗原识别区和胞内活化信号域的嵌合抗原受体(car结构)，所述胞外抗原识别区包括scfv、铰链结构和跨膜结构，所述铰链结构的氨基酸序列如seqidno.1或seqidno.2或seqidno.3或seqidno.4或seqidno.5所示。在某些实施例中，所述car结构中铰链区序列可以来源于：igg、igd、cd8、cd7、cd4。进一步，所述car结构的跨膜区的氨基酸序列如seqidno.6或seqidno.7所示。在某些实施例中，所述car结构中跨膜区可以来源于：cd8、cd28、cd3ε、cd4、cd16、cd137、cd80以及cd86。进一步，所述car结构的胞外抗原识别区的氨基酸序列如seqidno.11或seqidno.13所示。进一步，所述胞内活化信号域包含cd28和/或cd137和cd3。更进一步，所述胞内活化信号域的氨基酸序列为seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10的串联。在某些实施例中，所述car结构中胞内信号区可来源于：cd3、cd137、cd28、cd27、ox40、icos、gitr、cd2、cd40、pd-1、pd1l、b7-h3、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、icam-1、cd7、nkg2c、cd83、cd86以及cd127。在某些实施例中，所述scfv的vh如seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20和seqidno.21所示，所述scfv的vl如seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25和seqidno.26所示。进一步，所述car结构的氨基酸序列如seqidno.12或seqidno.14所示。进一步，所述car-t细胞靶向cea或psca。癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea)是1965年由gold和freedman首先从结肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原，是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于内胚层细胞分化而来的癌症细胞表面，是细胞膜的结构蛋白。在细胞浆中形成，通过细胞膜分泌到细胞外，然后进入周围体液。因此，可从血清、脑脊液、乳汁、胃液、胸腹水及尿液、粪便等多种体液和排泄物中检出。以往把cea作为早期诊断结肠癌和直肠癌的特异性标志物，经大量的临床实践，发现不仅胃肠道的恶性肿瘤cea值可以升高，在乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤的血清中也有升高。因此，癌胚抗原是一种广谱肿瘤标志物，虽然不能作为诊断某种恶性肿瘤的特异性指标，但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面，仍有重要临床价值。前列腺干细胞抗原(psca)是新近发现的一种细胞表面抗原，近几年的研究发现其与泌尿系肿瘤的发生发展及肿瘤的浸润转移和复发有一定关系。在某些实施例中，所述car-t靶向的靶点可以是cd19、cd20、cd123、cd22、cd16、nkg2d、bcma、ror1、cea、间皮素(mesothelin)、psca、psma、psa、muc1、dll3、fap、c-met、gpc-3、her2、epcam、il13rα2、egfr、egfrviii、gd-2、cd133、ny-eso-1、magea3、wt1或其任意的组合。有鉴于此，本发明的目的之二在于提供一种能增强所述car-t细胞归巢到实体肿瘤组织能力的试剂，该试剂可以趋化所述car-t细胞向肿瘤组织的迁移归巢和浸润。为实现上述目的，本发明所用以下方案：一种增强所述car-t细胞归巢到实体肿瘤组织能力的试剂所述试剂为dpp4抑制剂，所述dpp4抑制剂包括但不限于西格列汀、维格列汀、沙格列汀、阿格列汀和利格列汀。优选的，所述dpp4抑制剂为西格列汀。dpp-4抑制剂即二肽基肽酶4抑制剂，是一类治疗2型糖尿病的药物，该类药物能够抑制胰高血糖素样肽-1(glp-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(gip)的灭活，提高内源性glp-1和gip的水平，促进胰岛β细胞释放胰岛素，同时抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而提高胰岛素水平，降低血糖，且不易诱发低血糖和增加体重。而经过本发明申请人研究发现dpp-4抑制剂可以增强car-t细胞归巢到实体肿瘤组织并car-t细胞向肿瘤组织的浸润。本发明的目的之三在于提供一种所述试剂的应用，具体为dpp4抑制剂在所述car-t细胞中的一种应用。为实现上述目的，本发明采用以下方案：所述dpp4抑制剂在增强所述的car-t细胞肿瘤归巢和肿瘤富集，提高car-t疗法对实体肿瘤的治疗效果中的应用。进一步，所述肿瘤为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤包括但不限于淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌以及皮肤癌。所述dpp4抑制剂增强所述car-t细胞的肿瘤归巢和肿瘤富集能力，提高car-t疗法对实体肿瘤的治疗效果。所述car-t细胞的正常组织分布降低，减弱了正常组织的脱靶风险，安全性更高。本发明的目的之四在于提供所述试剂和所述car-t细胞的应用，具体为在cea和/或psca高表达的实体肿瘤治疗中的应用。本发明的目的之五在于提供一种药物组合物，具体为包含所述试剂的药物组合物，所述药物组合物包含car-t细胞和所述dpp4抑制剂。本发明的目的之六在于提供所述试剂的一种应用，具体为所述试剂在增强car-t细胞肿瘤归巢和肿瘤富集，提高car-t疗法对实体肿瘤的治疗效果中的应用。本发明的有益效果在于：1)本发明提供的所述试剂dpp4抑制剂可以增强car-t细胞的肿瘤归巢和肿瘤富集能力，提高car-t疗法对实体肿瘤的治疗效果；2)本发明提供的所述试剂dpp4抑制剂可以刺激所述的car-t细胞向肿瘤组织的浸润，增强car-t细胞对实体瘤的疗效；3)本发明提供了所述dpp4抑制剂的新用途，即除可应用于治疗糖尿病方面，还可结合car-t技术参与肿瘤的治疗。附图说明图1a为cea-car阳性率，图1b为psca-car阳性率。图2为dpp4抑制剂增强抗cea-car对结直肠癌细胞系的趋化能力的结果图。图3为dpp4抑制剂增强抗psca-car对car-t向宫颈癌细胞系hela的趋化能力的结果图。图4为cea-car-t联合dppi抑制剂治疗对lovo荷瘤小鼠肿瘤增殖的影响。图5a为lovo荷瘤小鼠肿瘤组织中car-t细胞比例的检测结果，图5b为lovo荷瘤小鼠肿瘤组织中car基因的拷贝数检测结果。图6为cea-car-t联合dppi抑制剂治疗对hela荷瘤小鼠肿瘤增殖的影响。图7a为hela荷瘤小鼠肿瘤组织中car-t细胞比例的检测结果，图7b为hela荷瘤小鼠肿瘤组织中car基因的拷贝数检测结果。具体实施方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1一种增强car-t细胞归巢到实体肿瘤组织能力的试剂一种增强car-t细胞归巢到实体肿瘤组织能力的试剂，所述dpp4抑制剂为西格列汀。实施例2一种car-t细胞及其制备(1)pbmc(外周血单个核细胞)的分离健康供者外周血加入20％体积的羟乙基淀粉(山东齐都药业有限公司)，充分混匀后室温静置30min。利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品公司)进行pbmc分离。分离获得的细胞用含10％fbs的新鲜1640培养液(gibco公司)重悬，置于37℃的co2培养箱中贴壁2h，以除去单核细胞。(2)t细胞的活化、病毒感染与扩增cd3(miltenyibiotec)和cd28(miltenyibiotec)包被活化(1)中获得的pbmc。活化后的细胞加入car病毒感染活化后的t细胞，感染病毒后的car-t细胞用含10％fbs的1640(gibco公司)培养液扩大培养，同时加入100iu/mlil-2(辽宁卫星生物制品公司)刺激增殖。car结构为：scfv-hinge-cd28tm-cd28-cd137-cd3z(3)流式检测car阳性率收集感染病毒8d的car-t和相应未感染病毒的t细胞，用pbs洗2次，加入抗人的proteinl抗体(santacruz公司)，轻拍混匀后4℃孵育30min，洗去未结合抗体，上机检测。如图1所示，图1a为cea-car阳性率；图1b为psca-car阳性率。实施例3dpp4抑制剂增强car-t细胞向肿瘤细胞趋化的能力由于体外趋化实验在没有趋化因子存在的情况下难以进行，因此体外实验外源加入了cxcl10(peprotech公司)，目的是增强体外实验灵敏度，但并不影响总体实验趋势。将生长状态良好的lovo(结直肠癌细胞系)和hela(宫颈癌细胞系)细胞消化、收集后，铺板6孔板37℃恒温co2培养箱培养2天。实验组在收集细胞前加入0.5mg/ml的dpp4抑制剂西格列汀，反应30min。收集细胞上清，离心去除细胞碎片，取600ul细胞上清到24孔板中，加入100μg/mlcxcl10因子，放入孔径为5μm的transwell小室。收集car-t细胞并计数，取5×105细胞新鲜培养液重悬后加到小室中，置于37℃恒温co2培养箱中培养2h。2h后取出小室，收集下室的细胞进行计数。结果如图2和图3所示，图2表示dpp4抑制剂增强抗cea-car对结直肠癌细胞系的趋化能力，结果如cxcl10+lovo组和dppi+cxcl10+lovo组所示，加入dpp4抑制剂后cea-car-t向肿瘤的迁移能力显著增强；图3表示dpp4抑制剂增强抗psca-car对car-t向宫颈癌细胞系hela的趋化能力，结果如cxcl10+hela组和dppi+cxcl10+hela组所示，加入dpp4抑制剂后cea-car-t向肿瘤的迁移能力显著增强。综上，实验结果表明dpp4抑制剂增强car-t细胞向肿瘤趋化的能力。实施例4dpp4抑制剂联合car-t细胞对小鼠肿瘤增殖的影响分别建立人cea阳性和人psca肿瘤细胞系的小鼠移植瘤模型用于验证car-t细胞与dpp4抑制剂剂西格列汀联合在动物模型中的抗肿瘤效果。体内验证使用小鼠为nod.cg-prkdcscidii2rgtm1sug/jiccrl，简称nog小鼠，由日本实验动物研究所(ciea)的mamoruito培育而成，为国际上car-t体内相关成瘤实验最常见品系。体内验证使用的成瘤靶细胞分别为lovo细胞和hela细胞。选择6-8周鼠龄雌性nod/scid小鼠，标记耳号后，在小鼠背部以1×106/只细胞量皮下注射lovo或hela细胞。成瘤第6天测量小鼠肿瘤体积，根据肿瘤体积随机分为空白组、car-t组和联合组三组(lovo，每组6只小鼠)或空白组、dpp4i(dpp抑制剂)组、car-t组和联合组四组(hela，每组5只小鼠)。将dpp4i组和联合组小鼠饲料换成添加西格列汀(1.2％)的加药饲料，空白组和car-t组继续给予普通饲料。成瘤第7天向car-t组和联合组小鼠尾静脉注射car-t细胞，每只的细胞量为1×107，空白组和dpp4i组给予相同体积的生理盐水。每周测量一次各组小鼠肿瘤体积，实验结果如图4和图6所示。图4为lovo荷瘤小鼠进行实验，可见cea-car-t与dppi抑制剂联合治疗效果更好；图6为hela荷瘤小鼠进行实验，可见psca-car-t与dppi联合治疗效果更好。综上，体内动物实验结果表明，在肿瘤治疗中car-t细胞与dpp4抑制剂联合具有更好疗效。实施例5dpp4抑制剂对car-t细胞肿瘤组织浸润影响的检测(1)单细胞分离取小鼠皮下肿瘤在培养皿中用解剖剪将肿瘤剪碎，加入消化液37℃co2培养箱消化30min，加入10ml含10％fbs的dmem培养液终止消化。将细胞悬液经70μm滤膜过滤后，680g离心15min用pbs清洗两次后新的pbs重悬，获得单细胞悬液。(2)流式检测肿瘤浸润性car-t细胞的含量将(1)分离的单细胞悬液吹打混匀后，取1×106活细胞，加入抗小鼠的封闭抗体，室温避光封闭15min，去除非特异性结合后，加入抗人cd3-fitc抗体，混匀后于4℃孵育30min，最后离心用pbs清洗2次去除未结合抗体，200μlpbs重悬后，在流式细胞仪上检测。结果如图5a和图7a所示，图5a为lovo荷瘤小鼠的实验结果，car-t联合dpp4抑制剂组(combine组)肿瘤组织中的car-t细胞比例显著高于单独回输car-t组；图7a为hela荷瘤小鼠的实验结果，car-t联合dpp4抑制剂组(combine组)肿瘤组织中的car-t细胞比例显著高于单独回输car-t组。综上，car-t联合dpp4抑制剂组(combine组)肿瘤组织中的car-t细胞数目显著高于单独回输car-t组，dpp4抑制剂可以促进car-t细胞向肿瘤组织的浸润。(3)qrt-pcr检测car基因拷贝数将小鼠皮下肿瘤组织称重后，取10mg左右的组织置于ep管中，依次加入500μlextractionbuffer、10μl蛋白酶k，颠倒混匀，将组织全部消化裂解。加入4μlrna酶70℃消化10min后，加入配好的nacl溶液，剧烈震荡后离心，上清液转至新的ep管中，加入预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀后，再次离心，弃上清，加入1ml70％乙醇，颠倒混匀再次离心弃上清，将ep管烘干后加入100μlte缓冲液重悬dna，获得肿瘤组织基因组。将上述获得的dna用于qrt-pcr：反应体系：试剂名称体积sybrpremixextaqii(2×)10μl上游引物(10μm)0.5μl下游引物(10μm)0.5μldna样品1μlddh2o8μltotal20μl反应条件：实验结果如图5b和7b所示，图5b为lovo荷瘤小鼠的实验结果，car-t联合dpp4抑制剂组(combine组)肿瘤组织中的car拷贝数显著高于单独回输car-t组；图7b为hela荷瘤小鼠的实验结果，car-t联合dpp4抑制剂组(combine组)肿瘤组织中的car拷贝数显著高于单独回输car-t组。综上，car-t联合dpp4抑制剂组(combine组)肿瘤组织中的car拷贝数显著高于单独回输car-t组，说明dpp4抑制剂可以促进car-t细胞向肿瘤组织的浸润。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。<110>重庆精准生物技术有限公司<120>增强car-t细胞归巢到实体肿瘤组织能力的试剂及其应用<160>26<170>patentinversion3.5<210>1<211>47<212>prt<213>artificial<220><223>cd8hinge<400>1lysprothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothr151015ilealaserglnproleuserleuargproglualacysargproala202530alaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphealacysasp354045<210>2<211>36<212>prt<213>artificial<220><223>cd7hinge<400>2alaproproargalaseralaleuproalaproprothrglyserala151015leuproaspproglnthralaseralaleuproaspproproalaala202530seralaleupro35<210>3<211>45<212>prt<213>artificial<220><223>cd8(dc)hinge<400>3lysprothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothr151015ilealaserglnproleuserleuargproglualaargproalaala202530glyglyalavalhisthrargglyleuaspphealaasp354045<210>4<211>229<212>prt<213>artificial<220><223>g4hh2h3<400>4gluserlystyrglyproprocysproprocysproalaprogluphe151015leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr202530leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval354045serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval505560gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser65707580thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu859095asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproser100105110serileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro115120125glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln130135140valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala145150155160valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr165170175proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu180185190thrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphesercysser195200205valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser210215220leuserleuglylys225<210>5<211>228<212>prt<213>artificial<220><223>g4hh2h3mt<400>5gluserlystyrglyproprocysproprocysproalaproproval151015alaglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu202530metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser354045glngluaspprog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